PHLPP1与PHLPP2在胃肠间质瘤中的表达及意义△

朱 辉 王淑君 夏 溪 谢林文 张亚儿 吴建胜

(温州医科大学附属慈溪医院消化内科 温州 315300)

胃肠间质瘤(GIST)是胃肠道最常见的间叶组织来源肿瘤，多发生于50岁以上的老年人，男性发病率高于女性。因GIST对常规放化疗缺乏敏感性，临床多给予以手术为主的综合疗法，与其他类型的良性肿瘤不同，其生物学行为具有不可预测性，术后仍存在较高的复发和转移风险[1]。目前，GIST的侵袭性主要借助核分裂数和肿瘤大小进行评估，是影响患者预后的关键因素，但影响其侵袭性的病理生理机制尚未完全明确。PHLPP蛋白是一种富含亮氨酸的磷酸酶，能够使磷酸化的蛋白激酶(P-AKT)脱磷酸化，抑制肿瘤相关信号通路磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的活性，终止细胞恶性增值，与肿瘤细胞的行为学特征和侵袭性密切相关[2～3]。当前研究背景下，PHLPP蛋白与肿瘤病理的相关性研究多聚焦于恶性肿瘤，而对GIST的研究较少，本研究推测GIST的细胞行为也可能受到PHLPP蛋白的影响，该实验立足于该假说，通过免疫组织化学实验分析PHLPP1与PHLPP2在GIST中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为本院2012年7月～2015年7月收治的29例胃肠道间质瘤患者。包括男17例，女12例；年龄47～73例，平均(58.2±8.5)例。纳入标准：(1)初诊为胃肠间质瘤，无既往治疗史；(2)术后病理和免疫组织化学实验确诊为胃肠道间质瘤；(3)以手术为主要治疗方案，且留有术后病理组织；(4)临床诊治、核分裂数、随访等资料齐全；(5)术前无远处病灶转移。排除标准：(1)合并有其他系统肿瘤；(2)随访期间死于其它疾病；(3)合并有免疫系统或血液系统功能异常；(4)合并有糖尿病、急性外伤等能引起全身炎性反应的其他疾病。

1.2 分组方法

所有病例的病理组织，均制备石蜡病理切片，于50倍镜下观察核分裂像数，根据美国国立卫生研究院确立的胃肠间质瘤分级标准分为极低危组9例、低危组13例、中危组和高危组8例。极低危组：肿瘤最大径<2cm，核分裂像数<5/50；低危组：肿瘤最大径2～5cm，核分裂像数<5/50；中危组：肿瘤最大径<5cm且核分裂像数6～10/50，或肿瘤最大径5～10cm且核分裂像数<5/50；高危组：肿瘤最大径>5cm且核分裂像数<5/50，或肿瘤最大径>10cm，或核分裂像数>10/50。

1.3 PHLPP1与PHLPP2表达水平测定方法

所得术后病理组织，均制备常规石蜡病理切片，厚度5～7μm，采用免疫组织化学实验测定PHLPP1与PHLPP2表达水平。主要步骤：(1)二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，浓度梯度分别为100%、95%、85%、75%、60%、50%、30%、纯水，各个梯度浸泡时间均为5min；(2)3%的H2O2处理10min阻断内源性过氧化物酶的活性，置于玻片架，浸泡于装满0.01M枸橼酸缓冲液的大烧杯，采用微波炉进行抗原热修复，先以中高火加热至沸，自然冷却，再以微波炉加热至沸腾，自然冷却，如此反复两次；(3)PBS洗涤3次×5min，5%的BSA液封闭20min，激进型抗体孵育。一抗孵育条件为4℃过夜，使用浓度为1∶500，PBS洗涤3次×5min，二抗孵育条件为37℃ 30min，使用浓度1∶800；(4)PBS洗涤3次×5min，链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)染色，37℃孵育30min，PBS洗涤3次×5min，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，浓度梯度分别为30%、50%、60%、75%、85%、95%、100%，各个梯度浸泡时间均为5min。二甲苯透明，中性树胶封片；(5)电子显微镜下观察染色后切片，染成黄色或棕黄色者为阳性细胞，直接采用ImagePro Plus软件分析阳性表达强度。

1.4 资料统计方法

采用Execl表格统计患者的临床资料，包括年龄、性别、确诊时间、主要临床症状与体征、病理诊断数据、治疗方式、术后随访时间、随访期有无复发和转移等。复发：原病灶区域出现肿瘤；转移：原病灶以外的其他位置出现肿瘤。

1.5 统计学方法

所有数据均采用统计学软件SPSS19.0进行分析，计量资料以均数±标准差表示，本组数据均符合正态分布，多组间的比较行方差分析，有统计学差异者进一步行LSD-T检验，两组间比较行两独立样本的t检验；计数资料以率表示，因总病例数<40，以Fisher确切概率法分析组间差异；术后生存曲线的绘制和分析采用Kaplan-Meier法；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的PHLPP1与PHLPP2表达水平

各组患者的病理组织PHLPP1与PHLPP2表达水平明显不同，极低危组的PHLPP1与PHLPP2表达水平高于低危组，低危组高于中高危组，任意两组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组患者PHLPP1与PHLPP2表达水平比较

组别例数PHLPP1PHLPP2极低危组93．635±0．6253．512±0．825低危组132．024±0．364∗2．884±0．527∗中高危组80．886±0．225∗#1．853±0．413∗#

注：*与极低危组相比，P<0.05；#与低危组相比，P<0.05。

2.2 各组的预后评估

本组病例术后随访时间为1～3年，至末次随访期，极低危组患者均无复发、转移或死亡；低危组复发、转移各1例，死亡1例；中高危组患者复发2例，转移3例，死亡3例。以复发率、转移与死亡患者为预后不良，中高危组的预后不良发生率明显高于极低危组，组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组患者的术后复发率、转移率和死亡率对比 [n(%)]

组别例数复发率转移率死亡率预后不良极低危组90000低危组131(7．7)1(7．7)1(7．7)2(15．4)中高危组82(25．0)3(37．5)3(37．5)5(62．5)∗

注：*与极低危组相比，P<0.05。

2.3 预后不良患者的PHLPP1与PHLPP2表达水平

以复发率、转移与死亡患者为预后不良，其他患者为预后良好，对比分析预后不良患者的PHLPP1与PHLPP2表达特点，结果显示预后不良患者的PHLPP1与PHLPP2表达水平明显低于预后良好者(P<0.05)，见表3。ROC曲线分析结果显示，PHLPP1与PHLPP2表达水平对预后不良均有预测价值(P<0.05)，其最佳截点分别为PHLPP1=1.810和PHLPP2=2.625，PHLPP1=1.810评估预后不良的敏感度为0.957，特异度为0.714；PHLPP2=2.625评估预后不良的敏感度为0.783，特异度为0.714，见图1。

表3 两组患者PHLPP1与PHLPP2表达水平对比

组别例数PHLPP1PHLPP2预后不良72．854±0．8543．052±0．883预后良好232．011±0．637∗1．975±0．447∗

注：*与预后不良相比，P<0.05。

图1 PHLPP1与PHLPP2表达水平预测预后不良的ROC曲线

注：PHLPP1表达水平Area=0.879，P=0.003；PHLPP1表达水平，Area=0.773，P=0.031。

3 讨论

GIST是一类异质性肿瘤，大多数未定向分化，关于其组织学起源，有两种观点[4]：一种观点认为GIST来源于胃肠道卡哈尔间质细胞(ICC)，其主要依据是两者电镜下具有相似的超微结构，且均表达CD117和CD34；另一种观点认为GIST来源于多潜能间叶干细胞(mMSC)，其主要依据是GIST不仅能向ICC分化，同时也可以向平滑肌分化，且GIST与mMSC均表达nestin，但ICC几乎不表达。其未分化性和组织来源的复杂性决定了其生物学行为的难以预测性，这也是GIST临床治疗的主要难点。美国国立卫生研究院确立的胃肠间质瘤分级标准将胃肠间质瘤的侵袭性分为4个级别，分别命名为极低危型、低危型、中危型和高危型，临床调查结果显示[5]，高危型胃肠间质瘤术后5年的复发和转移率多数高于50%。因此，深入挖掘与GIST侵袭性有关的病理机制，为其靶向治疗提供新思路，仍然是眼下的重要工作方向。

PHLPP是近十几年发现的一种抑癌基因，其主要作用底物是AKT与蛋白激酶C(PKC)，能够使两者去磷酸化从而抑制其相关信号转导通路的生物学作用。现有研究已证实[6～8]，在直肠癌、胃癌、肝癌等消化系恶性肿瘤中，以及乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤等其他非消化系恶性肿瘤中，PHLPP1和PHLPP2表达水平均有明显下调，体外研究证实[9～10]，通过靶向干预上调PHLPP1或PHLPP2表达，可以抑制多种肿瘤细胞的生长、增值与侵袭作用。GIST的侵袭行为也是临床医学面临的一大难题，但GIST不同于恶性肿瘤，其侵袭行为是否受到PHLPP的调控尚不得知。本研究发现，极低危组患的PHLPP1与PHLPP2的表达水平高于低危组，低危组高于中高危组，任意两组的差异均有统计学意义。该结果说明PHLPP1与PHLPP2均与GIST的侵袭性密切相关。研究进一步统计患者的随访资料，在1～3年的随访期内，极低危组无1例发生复发、转移或死亡，而中高危组复发2例，转移3例，死亡3例，预后不良发生率明显高于极低危组。既往研究指出GIST的侵袭性是决定患者预后的关键因素[11]，本研究结果支持该观点。另外，本研究还发现预后不良患者的PHLPP1与PHLPP2表达水平明显低于预后良好者，ROC曲线分析结果也证实PHLPP1与PHLPP2表达水平对预后不良均有预测价值，其中PHLPP1=1.810评估预后不良的敏感度和特异度分别为0.957和0.714；PHLPP2=2.625评估预后不良的敏感度和特异度分别为0.783和0.714。鉴于本组病例数较少，该数据可能存在一定的偏倚性，尚需要大样本的调查研究加以验证，但本研究结果证实PHLPP1和PHLPP2可能与GIST的侵袭性以及患者预后均有密切相关性。

综上所述，本研究分析30例GIST患者病理组织PHLPP1和PHLPP2表达水平与临床数据的关系，发现PHLPP1与PHLPP2表达水平可能与GIST的侵袭行为密切相关，对患者预后具有一定的预测价值。

1 Rusakiewicz S,Perier A,Semeraro M,et al.NKp30 Isoforms and NKp30 Ligands are Predictive Biomarkers of Response to Imatinib Mesylate in Metastatic GIST Patients.Oncoimmunology,2017,6(1):e1137418.

2 Xing Y,Sun W,Wang Y,et al.Mutual Inhibition of Insulin Signaling and PHLPP-1 Determines Cardioprotective Efficiency of Akt in Aged Heart.Aging,2016,8(5):873～887.

3 Smith AJ,Wen YA,Stevens PD,et al.PHLPP Negatively Regulates Cell Motility Through Inhibition of Akt Activity and Integrin Expression in Pancreatic Cancer Cells.Oncotarget,2016,7(7):7801～7815.

4 王昊,陈平,柳欣欣,等.胃肠间质瘤p-AKT(Thr308)和p-AKT(Ser473)表达及其临床意义和预后分析.肿瘤,2014,34(6):541～546.

5 赵传华,徐建明.胃肠间质瘤的治疗进展.临床肿瘤学杂志,2014,19(5):465～468.

6 Wen YA,Stevens PD,Gasser ML,et al.Downregulation of PHLPP Expression Contributes to Hypoxia-Induced Resistance to Chemotherapy in Colon Cancer Cells.Mol Cell Biol,2013,33(22):4594～4605.

7 Qin Y,Meng L,Fu Y,et al.SNORA74B gene Silencing Inhibits Gallbladder Cancer Cells by Inducing PHLPP and Suppressing Akt/mTOR Signaling.Oncotarget,2017,8(12):19980～19996.

8 O'Neill AK,Niederst MJ,Newton AC.Suppression of Survival Signalling Pathways by the Phosphatase PHLPP.FEBS J,2013,280(2):572～583.

9 Wen YA,Li X,Goretsky T,et al.Loss of PHLPP Protects Against Colitis by Inhibiting Intestinal Epithelial cell Apoptosis.Biochim Biophys Acta,2015,1852(1000):2013～2023.

10 Nitsche C,Edderkaoui M,Moore RM,et al.The Phosphatase PHLPP1 Regulates Akt2,Promotes Pancreatic Cancer Cell Death,and Inhibits Tumor Formation.Gastroenterology,2012,142(2):377～87.e1～5.

11 叶云虹.156例不同侵袭危险性胃肠道间质瘤的临床相关资料分析.昆明医科大学,2016.