灭字脊虎天牛触角转录组中气味结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析

吉帅帅，庄翔麟，刘乃勇，2*

（1.西南林业大学生物多样性保护与利用学院，昆明 650224；2.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，昆明 650224）

高度发达和极其灵敏的嗅觉系统在昆虫觅食、交配、产卵、躲避天敌等行为活动中起着关键作用[1]。触角是昆虫嗅觉识别的重要器官，其表面着生有不同类型的感器，主要包括毛形感器、刺形感器、锥形感器和腔锥形感器等，它们在昆虫的嗅觉感受过程中具有重要作用[2-3]。目前，较为认同的一种嗅觉途径是：气味分子通过触角感器表面的微孔进入感器淋巴液，与淋巴液中的气味结合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）结合并穿过神经树突中的水淋巴液，从而启动后续一系列的嗅觉反应，完成昆虫对气味分子的感受过程[4-6]。在这一过程中，OBP选择结合特定类型的气味分子，起着过滤器的作用[7]。

OBP是一类小分子的可溶性蛋白，分子量为15～30 kDa，一般多肽链全长120～160个氨基酸，N末端具有20个氨基酸左右的信号肽[8]。经典OBP（classic OBP）具有6个保守的半胱氨酸残基（cysteine，Cys），能够形成3对二硫键，起稳定蛋白三级结构的作用。1981年，R.G.Vogt等[9]用标记性信息素的方法，从多音大蚕蛾（Antheraea polyphemus）雄蛾触角中发现昆虫的第一个OBP，命名为性信息素结合蛋白（pheromone-binding proteins，PBPs）。随着高通量测序技术的不断发展，多个昆虫物种的OBP基因已经得到鉴定，如在非鞘翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）[10]、梨小食心虫（Grapholitha molesta）[11]、棉铃虫（Helicoverpa armigera）[12]、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）[13]中分别鉴定到 44、28、40、51 个 OBP 基因。在鞘翅目昆虫红棕象甲（Rhyncophorus ferrugineuss）[14]、红脂大小蠹（Dendroctonus valens）[15]、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）[16]、松褐天牛（Monochamus alternatus）[17]、黄粉虫（Tenebrio molitor）[18]、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）[19]、黄斑星天牛（Anoplophora nobilis）[20]中分别鉴定到 11、21、49、29、19、42、16个OBP基因。OBP在昆虫不同组织的表达谱具有多样性，不仅在触角有表达，还在下唇须、头部、胸、腹、足、翅、性腺等其他组织也有表达[21-22]。这说明昆虫的OBP可能具有多种功能，包括嗅觉和非嗅觉功能，如研究发现黑腹果蝇的OBP76a能够感受求偶信息素 11-cis vaccenyl acetate（cVA）[23]；但是在桃蚜（Myzus persicae）中，OBP则被暗示参与翅型的分化[24]。

灭字脊虎天牛（Xylotrechus quadripes Chevrolat）属鞘翅目Coleoptera，天牛科Cerambycidae，天牛亚科Cerambycinae，是严重危害咖啡的一种重要蛀干害虫，广泛分布在印度、中国、印度尼西亚、泰国、缅甸、越南等世界咖啡种植国家和地区，我国主要分布在云南、广西、广东、台湾、福建等省。其中，在云南省该虫主要分布在普洱、西双版纳、德宏、保山、临沧等咖啡种植地区[25]。前人对灭字脊虎天牛的研究主要集中在虫情调查、种群动态和发生规律等方面[26-29]，基于分子水平的研究相对较少，包括灭字脊虎天牛与寄主植物互作的分子机制方面的研究。随着人们对绿色环保理念认识的不断提高，以及农药残留和抗性引起的一系列问题，研发新型的害虫防治技术已成为近年来农林业害虫控制的一种重要手段。其中，基于嗅觉的害虫行为引诱剂或干扰剂已在鳞翅目等一些昆虫中得到应用，但在灭字脊虎天牛中尚未见报道有效的行为调控剂，OBP等嗅觉相关基因的鉴定可为基于反向化学生态学的研究提供潜在分子靶标[30]。本文对灭字虎天牛主要的化感器官——触角进行了转录组测序，采用生物信息学和分子生物学技术鉴定和研究了参与嗅觉感受的重要化感基因OBP家族，研究结果可为后续OBP的功能研究以及行为调控剂的筛选奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验昆虫与组织收集

灭字脊虎天牛成虫采自云南省瑞丽市，纬度N24°01′37.60″，经度 E97°51′03.59″，海拔 783 m。野外解剖受害的咖啡树干，将羽化5～7 d的灭字脊虎天牛雌雄成虫分开，饲喂新鲜的咖啡木段。室内将触角、头（无触角）、胸、腹、足、翅分别收集至加有Trizol试剂的无RNA酶离心管中，每个组织收集2套生物学模板，存放于-80℃冰箱备用。

1.2 触角RNA的提取及转录组测序

用Trizol法提取灭字脊虎天牛触角总RNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。采用Nanodrop检测RNA纯度（OD260/280比值），Agilent 2100检测RNA的完整性。将检测合格的灭字脊虎天牛触角总RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司构建cDNA文库并进行RNA-seq测序。用带有Oligo（dT）的磁珠富集纯化出mRNA，随后加入fragmentation buffer将mRNA打成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一链cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成第二链cDNA，再用AMpure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行修复，加A尾并连接测序接头，再用AMpure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMpure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1.5 ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2 nmol/L），以保证文库质量。库检合格后，利用Illumina HiSeqTM2000进行测序。

1.3 转录本拼接和基因的功能注释

测序得到的原始数据经质量分析，去除带接头的序列、无法确定碱基信息的序列（比例大于10%）以及低质量的序列后得到clean reads，以保证信息分析质量。然后采用Trinity（版本：r20140413p1）对clean reads进行拼接后形成最终的转录本。将每一条转录本在Blast nr库中进行比对，E-value≤1.0E-5认为比对结果是可信的，最终获得基因功能注释的Unigenes。

1.4 基因的鉴定

采用BLAST同源搜索的方法，从灭字脊虎天牛的触角转录组中鉴定OBP基因。首先，从NCBI（national center for biotechnology information） 数据库中下载松褐天牛、云斑天牛（Batocera horsfieldi）、赤拟谷盗、华山松大小蠹（Dendroctonus armandi）、大猿叶虫（Colaphellus bozoringi）的OBP基因作为靶标序列，在BioEdit中采用Blast进行同源性搜索，鉴定候选的OBP基因。然后，将所有OBP基因再次在NCBI nr中进行比对，确定候选的OBP基因。根据氨基酸序列中保守Cys的数量和位置对OBP进行分类：Classic OBPs有6个保守的Cys；Minus-C OBPs含有4个保守的Cys[8]。

1.5 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）预测开放阅读框（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。利用在线软件 SingalP 4.1 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/SingalP）对OBP进行信号肽预测及分析[31]。OBP序列之间的一致性利用Gene Doc进行计算。序列比对采用ClustalX1.8.3。在系统发育树的构建中，采用ClustalW进行多序列比对，然后选取灭字脊虎天牛、松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和黄斑星天牛共85个OBP序列，利用MEGA7.0软件邻位相连法（neighbour-joining）构建进化树，对结果进行1 000次Bootstrap验证[32]。

1.6 组织表达谱分析

收集不同组织时选取触角20对、头部（去除触角）10个、胸10个、腹部10个、足和翅各30对（雌雄各组织按1∶1比例混合），分别提取各组织总RNA，利用DNase I去除各组织中的基因组DNA，然后将其反转录成cDNA。选取灭字脊虎天牛肌动蛋白基因actin作为内参基因，以检测各组织cDNA模板质量。采用RT-PCR研究OBP基因在以上各组织的表达情况。PCR条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，最后根据目的条带的有无判断OBP在不同组织中的表达情况。PCR所用特异性引物见表1。

2 结果与分析

2.1 转录组分析及基因功能注释

采用Illumina HiSeqTM2000测序平台对灭字脊虎天牛成虫触角进行转录组测序，测序深度2.97 G，共获得20 894 468个raw reads，去除接头序列、污染序列及低质量的序列后共获得19784872个clean reads。利用Trinity软件对过滤后的reads进行从头拼接，最终得到41 609个转录本（见表2）。通过GO数据库共有11 610个Unigenes得到注释，注释到53个GO功能分类中。其中，生物过程（biological process）包含 25 个亚类，细胞过程（cellular process）所占比例最高，代谢过程次之；细胞组分（cellular component）包含18个亚类，细胞和细胞部分所占比例最高；分子功能（molecular function）包含10个亚类，结合功能所占比例最高（见图1）。

表1 灭字脊虎天牛OBP基因表达谱分析所用引物Table 1 Primers used for expression patterns of OBP genes from X.quadripes

表2 测序结果统计Table 2 Summary of sequence results

2.2 气味结合蛋白基因的鉴定

通过同源性比对的方法，从灭字脊虎天牛触角转录组中共鉴定到24个OBP基因。序列比对结果表明，OBP2、OBP3、OBP4、OBP6、OBP8、OBP10、OBP 21、OBP23和OBP24有6个保守的Cys，属于Classic OBPs；OBP1、OBP5、OBP7、OBP9、OBP11-OBP20、OBP22有4个保守的Cys，属于Minus-C OBPs。所有鉴定的OBP基因都具有完整的开放阅读框，编码123～180个氨基酸，且在N段具有一段长度不等的信号肽序列（16～23个氨基酸）。XquaOBPs的基本信息见表3。

2.3 气味结合蛋白的序列及进化分析

图1 灭字脊虎天牛转录本的GO分类Figure 1 Gene ontology(GO)classification of X.quadripes transcripts with Blast2 GO program

表4 灭字脊虎天牛OBP序列一致性分析Table 4 Sequence identity analysis of X.quadripes OBPs

利用ClustalX1.8.3对灭字脊虎天牛24个OBP的氨基酸序列进行对比，灭字脊虎天牛的OBP至少拥有4个保守的半胱氨酸Cys残基（见图2）。序列一致性分析表明，24个OBP间氨基酸差异性较大，一致性为 6%～81%（见表4）。其中XquaOBP5和Xqua OBP7一致性最高，为81%；XquaOBP12和XquaOBP 14一致性次之，为77%；而XquaOBP8和XquaOBP23的一致性最低，仅有6%。为了进一步明确24个OBP之间的亲缘关系，对其进行了系统进化分析。结果显示，XquaOBP5、OBP7、OBP9 和 OBP11-OBP20聚类到Minus-C OBPs进化枝。XquaOBP1、OBP2、OBP3、OBP4、OBP6、OBP8、OBP10、OBP21、OBP22、OBP23和OBP24聚类到Classic OBPs进化枝，但是序列比对结果显示XquaOBP1和XquaOBP22为Minus-C OBPs亚家族。此外，我们进一步构建了XquaOBP与松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和黄斑星天牛OBP的进化树。结果表明，灭字脊虎天牛OBP聚类到不同的分枝上，暗示它们可能有着不同的功能。XquaOBP1聚类到Classic OBPs进化枝，但在序列结构上属于Minus-C OBPs亚家族（见图3）。

图2 灭字脊虎天牛OBP的序列比对Figure 2 Sequence alignment of X.quadripes OBPs

2.4 气味结合蛋白的表达谱分析

采用RT-PCR技术，检测了24个OBP基因在成虫触角、头部（去除触角）、胸、腹、足、翅中的表达。结果表明，XquaOBP4、OBP8、OBP18、OBP21 在触角特异表达；XquaOBP2、OBP3、OBP7 和 OBP20在触角高表达；其余OBP除在触角表达外，还在其他组织中也有表达，如XquaOBP3在头部和腹部表达，XquaOBP6头部、腹部及翅表达，XquaOBP20在头部、胸部、足及翅中表达，XquaOBP7、XquaOBP11-OBP17、XquaOBP19、XquaOBP22-OBP24 在检测的所有组织中均有表达（见图4）。

3 讨论

近年来，国内外许多实验室对昆虫嗅觉基因进行了大量的研究，研究对象主要集中在鳞翅目以及双翅目的一些模式昆虫、重要农林业及卫生害虫[33]，而鞘翅目昆虫的研究相对较少，天牛科昆虫的研究更是鲜有报道，可能是由于该类昆虫是一种钻蛀性害虫，野外采集和室内饲养难度较大、室内饲养周期长等原因导致实验材料收集困难。如灭字脊虎天牛在普洱地区一年发生3代（3个成虫羽化高峰期）[25]，每代均跨年度完成，世代重叠严重，同一代虫态发育不整齐，成虫羽化时间还易受气候条件等因素的影响。而鳞翅目许多昆虫如棉铃虫、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、小菜蛾（Plutella xylostella）等均可在室内进行饲养，周期短且技术成熟，可以提供源源不断的实验材料[34-37]。

图3 灭字脊虎天牛和其他4种天牛OBP的邻近树Figure 3 Neighhor-joining tree of OBPs from X.quadripes and four other longhorned beetles

在天牛科昆虫中，目前已有松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛以及黄斑星天牛嗅觉相关的OBP基因得到鉴定[18-20，38]。灭字脊虎天牛作为危害和制约咖啡产业发展的一种重要蛀干害虫，本文对其嗅觉相关的OBP基因进行了初步研究。首先，从触角转录组中鉴定到24个OBP基因，该数量少于先前报道的鞘翅目其他昆虫中OBP基因的数量，包括大猿叶虫的26 个[39]、中欧山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）的31个[40]和赤拟谷盗的49个[16]，分析可能原因如下：①不同转录组测序深度存在差异；②灭字脊虎天牛OBP基因的鉴定来自于转录组，并非基因组数据。因此，灭字脊虎天牛的部分OBP基因可能仍未得到鉴定。

图4 灭字脊虎天牛OBP基因在不同组织中的表达谱Figure 4 Expression pattern of OBPs in different tissues of X.quadripes

序列比对表明，XquaOBP1序列中有4个保守的Cys，从划分上应属于Minus-C OBPs，但在Xqua OBP进化分析中聚类到Classic OBPs分枝。Xqua OBP1 与黄斑星天牛 AnobOBP1、AnobOBP8、Anob OBP9进化聚类分析结果类似，李广伟等[20]认为可能是黄斑星天牛的这3个OBP与Classic OBPs在进化上更加同源或与这3个OBP相似性高的Minus-C OBPs没有被鉴定。类似的情况很可能也出现在XquaOBP1中。鞘翅目不同OBP的系统发育树表明，灭字脊虎天牛24个OBP可分为2个亚家族：9个属于 Classic OBPs家族，15个属于 Minus-C OBPs家族。Minus-COBPs家族占OBP总数的62.5%。黄斑星天牛、松褐天牛、云斑天牛OBP中Minus-C OBPs分别占总数的68.8%、51.7%、60.0%。因此，在天牛科物种中Minus-C OBPs家族的基因数量均多于Classic OBPs，很可能是天牛科昆虫OBP基因存在的一个普遍规律。

研究表明，XquaOBP4、OBP8、OBP18、OBP21 在触角特异表达，推测其与灭字脊虎天牛寻找寄主或感受异性释放的性信息素有关。其余OBP基因在除触角以外的组织中有表达，很可能在灭字脊虎天牛生长发育过程中执行非嗅觉功能。

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