用SSR标记揭示部分烤烟种质资源的遗传差异

2018-05-07罗文学官思成刘永建

四川农业大学学报 2018年2期

刘林，罗文学，官思成，彭永，李成，刘永建

（四川农业大学农学院，成都 611130）

烟草（Nicotiana tabacum）是一种重要的经济作物，烟草已经成为美国第6种重要作物；在地方经济发展、国家财政累积等方面烟草行业的重要性突出，许多国家资金收入也来源于烟草行业的经济效益。我国烟叶生产约占世界总量的三分之一，是世界上最大的烟草生产国和消费国，2005年，全世界烟叶产量预计为503.9万t，其中烤烟产量将达到387.34万t，我国烤烟产量占世界总产量的46.78%，预计可达181.2万t[1]。目前，我国已形成以烤烟为主体，白肋烟、香料烟等类型齐全多样的烟草类群。保证烟草生产质量的前提是优良种质的使用，我国烟草种质资源虽然丰富，但种质资源挖掘和创新力度不够、过度依赖骨干系等是目前育种上面临的问题[2]。单一育种目标的定向选择导致亲本集中在少数核心种质资源上[3]，丰富的种质资源及合理的亲本选配是育种计划成功的关键[4]，烟草遗传多样性的测定在品种鉴定和育种计划中具有很高的应用潜力。

烟草种质资源遗传多样性与亲缘关系分析中广泛应用分子标记技术，SSR分子标记相对其他分子标记技术存在一些显著优点，如稳定性好、信息量丰富、操作简便等[5]。与其他作物相比，烟草SSR分子标记技术的研究起步较晚，直到2007年，G.Bindler等[6]首次报道了烟草的微卫星标记并利用这些标记构建了遗传图谱，总共282个微卫星标记扩增的293个SSR位点被定位到烟草24个连锁群（染色体）上，并公布了278对烟草SSR引物。此后，SSR分子标记在烟草种质资源遗传多样性与亲缘关系中的研究才得以实现。刘胜传等[7]利用SSR分子标记对32份不同类型的烟草种质进行遗传多样性分析，建议尽可能选择遗传距离大的品种进行杂交育种；徐军等[8]利用8个SSR标记在80份普通烟草种质中共检测到85个多态性位点，8个SSR标记可以完全区分80份烟草种质，表明SSR标记完全适用于普通烟草种质鉴定。张雪廷等[9]利用SSR引物对38份晾晒烟种质资源的遗传关系进行了分析，30对SSR引物共检测到173个等位基因位点，遗传相似系数（GS）的变化范围为0.140～0.928，平均为0.534，表明38份晾晒烟的遗传多样性丰富，遗传差异较大，亲缘关系较远；聚类结果显示遗传相似系数为0.165时，美国从烟草起源地收集的材料Ti245和Ti112能与其他36份晾晒烟栽培品种区分开，表明SSR标记能从分子水平上揭示晾晒烟种质资源的遗传背景和亲缘关系。

本文从278对烟草SSR引物中筛选出分布在21个连锁群上的56对稳定性高、多态性好的引物，对搜集的59份烤烟种质进行遗传差异分析，从分子水平上揭示烤烟种质之间的遗传距离，以便为充分发掘、利用烤烟种质资源，合理选配亲本和高效育种等提供重要理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

参试烤烟材料共59份，分别来自中国、美国、津巴布韦、巴西等国家（见表1），均由中国农业科学院烟草研究所提供。

1.2 DNA提取

本研究采用CTAB改良法提取DNA[10]，将DNA晾干后加入100 μL无菌水，放在常温下待DNA沉淀溶解后加入0.1 μL RNase，常温下放置24 h，然后放于4℃冰箱中保存，或置于-20℃或-70℃冰箱中长期保存。

1.3 SSR引物

本试验所用的SSR引物序列均来自G.Bindler等[6]于2007年公布的引物，通过预实验进行引物筛选，从280对SSR引物中选出56对稳定性高、多态性好的SSR引物，均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 PCR扩增

扩增体系为 20 μL：含 25 ng 的 DNA，1.5 U Taq DNA聚合酶，MgCl2在体系中的浓度为1.5 mmol/L，浓度为200 μmol/L的dNTPs，正反向引物的浓度均为 0.05 μmol/L。

扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，40个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。

用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测扩增产物，电泳缓冲液为1×TBE，恒压300 V，溴酚蓝离胶底部2～3 cm处结束电泳，然后银染，拍照保存。

表1 供试烟草材料Table 1 The selected flue-cured tobacco material

续表

1.5 数据处理与分析

选择带型清晰且稳定性好的电泳图谱，清晰且可重复出现的条带记为“1”，相同迁移位点上无条带记为“0”，建立数据矩阵。

按Nei&Li的公式[12]计算供试材料间的遗传距离：

其中，Nij为材料i和j共有的扩增条带数；Ni为材料i的扩增条带数；Nj为材料j的扩增条带数。把距离矩阵保存成txt文件，用MEGA6.0[13]构建树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 扩增结果

利用上述56对SSR引物对59份参试烤烟种质（见表1）进行扩增（引物的扩增结果见图1），SSR反应扩增的片段长度在50～500 bp范围内，共检测到等位基因位点271个，每个标记检测到的位点数为2～12个，平均多态性位点数为4.8个；其中241个位点具有多态性，多态性位点的比例为88.93%，每个标记检测到的多态性位点数为1～9个，平均多态性位点数为4.3个，检测到的多态性位点最多的引物是 PT20289，为 9 个，引物 PT30307、PT30107、PT30292和PT30480扩增的多态性位点数最少，只有 1个。引物 PT30307、PT30098、PT30107和PT30140扩增位点的多态性比率分别为33.3%、37.5%、33.3%和37.5%，其他引物扩增位点的多态性比率均高于或等于50.0%。引物的PIC值变化范围为 0.532～0.931，PCI值平均为 0.792，PIC 值最高的引物是PT20289，为0.931。这些多态性引物不均匀地分布在染色体上，其中具有差异的标记较多的染色体是10和23（见表2）。

2.2 遗传距离

由SSR数据估算出烤烟种质间的遗传距离，59份种烤烟种质的遗传距离在0.029～0.419之间，平均遗传距离为0.214，大型黄金与NC82的遗传距离较大，为0.419；Narrow Leaf Orinoco与Broad Leaf Orinoco的遗传距离最小，为0.029。

2.2.1 不同地理来源烤烟的遗传距离

为了比较不同地理来源之间的遗传差异，将59份烤烟种质进行分组，比较各组间平均遗传距离以及组内平均遗传距离（见表3），中国烤烟种质平均遗传距离最大为0.239，美国烤烟种质平均遗传距离为0.186，津巴布韦最小为0.122。不同地理来源烤烟种质之间的平均遗传距离在0.168～0.223之间，中国与美国烤烟品种之间的平均遗传距离较大为0.223，中国与津巴布韦烤烟品种之间的平均遗传距离为0.207，美国和津巴布韦烤烟品种之间的平均遗传距离较小为0.168。

图1 引物PT20287的扩增结果Figure 1 Amplification results of PT20287

表2 56对SSR引物名称、所在连锁群、多态性信息含量、多态性位点数及多态性比率Table 2 The name of 56 pairs of SSR primer，linkage group，number of polymorphic loci，the percentage of polymorphic loci and PIC of primer

表3 各组间及组内平均遗传距离Table 3 The average genetic distance between groups

2.2.2 烤烟选育品种与地方品种的遗传距离比较

为了比较烤烟选育品种与地方品种之间的遗传差异，根据选育方式将美国和中国的烤烟种质进行分组，比较各组间平均遗传距离以及组内平均遗传距离（见表4）。美国烤烟选育品种和地方品种的平均遗传距离分别为0.194和0.145，中国烤烟选育品种和地方品种的平均遗传距离分别为0.202和0.289；美国选育品种和地方品种之间的平均遗传距离较小为0.183，中国选育品种和地方品种之间的平均遗传距离较大为0.271。

表4 各组间及组内平均遗传距离Table 4 The average genetic distance between groups

2.3 聚类结果

为了更直观了解 59份烤烟种质间的遗传关系，利用56个SSR标记产生的遗传距离矩阵按UPGMA方法构建了聚类图（见图2）。由图2可以看出，第一等级划分（L1取值为GD=0.13），可将59份烤烟种质划分为1个大类群、2个小类群和1个由单一烤烟种质形成的独立个类。第一大类为来自美国、中国和津巴布韦等6个国家的54份烤烟种质，第二小类群包含一个选育品种中烟14和一个地方品种镇雄烤烟，第三小类群包括2个烤烟地方品种，即净叶黄和大型黄金，独立个类是来自美国的Pofit Granville。第二等级划分（L2取值为GD=0.09），可将54份烤烟种质划分为2个大类群，3个小类群和9个由单一烤烟种质形成的独立个类。①第一大类群（II1）共23份烤烟种质，分别为Kutsaga 110、Kutsaga 51E、K326、Coker187-Hicks、Brand B、Virginia Toyer、Speight G28、Dixie Bright 101、云烟 2 号、中烟86、云烟87、中烟 103、峨山烤烟、贵烟1号、云烟116、云烟 110、云烟 119、MS 云烟 85、PVH1452、川烟 1 号、NC102、MS 云烟 87、MS Y01；②第二大类群（II2）包括 13 份烤烟种质，分别为 NC82、Hicks 55、Coker 319、Coker 298、Yellow Orinoco、Vesta 33、Narrow Leaf Orinoco、Broad Leaf Orinoco、Hicks（Broad Leaf）、Hicks、Bright Yellow、Bell 15、小黄金；③第一小类群（II3）包括 K394、Vesta 64、红花大金元、MS Y02 这 4份烤烟种质；④第二小类群（II4）包括3个烤烟种质，即NC2326、Oxford 26和柳叶尖2017；⑤第三小类群（II3）包括Ti448A以及由Ti 448A对 MS Coker 176回交转育的不育材料MS Y03；⑥9个独立个类中包含5个地方品种，分别为Virginia Bright Leaf、竖叶子0987、Yellow Mammoth、永定401和小黄金0006，以及 Coker 258、Special 402、中烟 90 和云烟97这4个选育品种。

3 讨论与结论

3.1 SSR标记能有效反映烤烟种质资源的遗传差异

H.S.Moon等[14]利用46个SSR标记对54份烟草材料进行遗传多样性分析，其中包括7份普通烟草种质或者品种，44份野生烟草种质和3份合成双二倍体材料，共检测等位基因位点529个，平均每个SSR标记检测到11.5个等位基因。H.S.Moon等[15]利用69对烟草SSR引物对117份美国烤烟品种进行遗传多样性分析，共检测等位基因位点294个，每个标记检测到的等位基因位点数为2～12个，平均为4.26个，引物的PIC值变幅在0.009～0.862之间。H.S.Moon等[16]利用70个SSR标记分析702份烟草材料，共检测到等位基因位点1 031个，每个标记检测到的等位基因位点数为2～41个，平均为14.7个。何其芳等[17]利用SSR标记技术分析了50份不同地理来源烟草种质材料的遗传多样性，20对SSR引物共检测到81个多态性位点，50份烟草种质之间相似系数的变化范围为0.53～0.97，平均每对引物检测的多态位点数为4.1；PIC值的变幅为0.139～0.944，平均为0.548。本研究利用56对SSR引物对59份烤烟种质进行扩增，共检测出241个多态性位点，每个标记检测到的等位基因位点数为1～9个，平均为4.3个。本研究与H.S.Moon等[15]、何其芳等[17]的研究结果相似，而与H.S.Moon等[14，16]的研究结果存在较大差异，平均每个标记检测的等位基因数约是本试验的3倍，是由于H.S.Moon等[15]搜集到烟草材料种类多、数量大、地域广，我们的试验材料虽然数量较大但种类比较单一，大部分烤烟种质都是来自美国和中国。本研究SSR引物的PIC值变化范围为0.532～0.931，平均约为0.793，PIC值最高的引物是PT20289，最低的是PT30292，56对SSR引物的PIC含量均高于0.5，说明这些引物能鉴别烟草遗传差异性。56个SSR标记不均匀地分布在烟草24个连锁群中，集中分布于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、18、19、21、22、23 和 24 号连锁群上，其中10和23号连锁群均含有6个多态性标记，4、17、21、22和24号连锁群均只含有1个多态性标记；试验所筛选出的56对SSR引物是Bindler针对烟草物种开发的一系列微卫星标记，56个SSR标记位点遍布烟草物种的21个连锁群，覆盖率达87.5%，说明该分子标记能够较准确的检测出供试烤烟种质的遗传差异。上述结果表明SSR标记能够有效地反映烤烟种质资源的遗传差异。

图2 基于SSR数据绘制供试材料间的聚类图Figure 2 Dendrogram derived from cluster analysis based on SSR analysis method among the selected material

3.2 烤烟种质资源遗传基础相对狭窄

G.Bindler等[6]利用SSR标记对烟草品种的亲缘关系进行分析，16份普通烟草品种间的遗传相似系数的变化范围为0.212～0.918，聚类结果显示，白肋烟、烤烟和香料烟分别聚为一类，只有深色晾晒烟没有聚为一个类群。叶兰钦等[18]发现云南主栽烤烟品种间的遗传距离狭窄，13个品种之间遗传距离的变化范围为0.009 0～0.428 6，平均遗传距离为0.223 7；可将13个品种划分为一大类群和3个由单一烤烟种质形成的独立个类，第一大类群包括云烟系列、K326、K346以及G28，3个独立各类分别是NC82、V2、红花大金元。聂琼等[19]利用22对番茄和辣椒的SSR引物对烤烟进行遗传差异分析，24份烤烟材料的遗传相异系数在0.344 5～0.862 6之间；聚类结果显示，24份材料可分为4大类，其聚类结果与实际亲缘关系基本一致。吴兴富等[20]利用48对分布在24条连锁群上的SSR引物对烤烟品种的亲缘关系进行分析，33份烤烟品种间的遗传相似性系数（GS）介于0.84～0.96之间，平均相似系数为0.90，表明33份烤烟品种间的遗传差异较小；聚类结果显示，在GS分别为0.894和0.910时可清晰地将美国引进及合作选育的27份品种与国内主栽品种区分开。本研究中59份种烤烟种质的遗传距离介于0.029～0.419之间，平均遗传距离为0.214，最大的遗传距离不超过0.5，这与叶钦兰等[18]、吴兴富等[19]的研究结果相似，表明这些烤烟品种亲缘关系较近、遗传基础狭窄，其中Narrow Leaf Orinoco与Broad Leaf Orinoco之间的遗传距离最小，为0.029，这两个品种都来自同一个原始种Orinoco。本研究中中国烤烟种质的平均遗传距离比美国、津巴布韦大，津巴布韦烤烟种质的平均遗传距离最小，可能是品种选育过程中偏向于某一骨干亲本的使用；对选育品种和地方品种的比较发现中国地方品种的平均遗传距离最大，美国地方品种最小，选育品种和中国地方品种之间的平均遗传距离较大，中国烤烟地方品种是在自然条件下经过长期自然选择和人工选择所形成的生态类型，国内地方品种资源丰富，遗传差异大，而美国地方品种都来自同一个原始种Orinoco，因此遗传差异小。

聚类结果显示在GD为0.13时能将部分地方品种区分开；GD为0.09时，能大致将国内烤烟种质和国外引进烤烟种质区分开，聚类结果与实际亲缘关系一致，这与吴兴富等[19]的研究结果相同，例如MS Y03与Ti448A聚为一类，MS Y01是Ti448A对MS Coker 176回交转育的不育材料；但是仍有部分烤烟种质如K326、Speight G28和Dixie Bright 101未区分开，是由于我国南方烤烟选育的绝大部分品种主要来源于K326、红花大金元，北方烤烟育种大多数使用G28、净叶黄和红花大金元等主体亲本，种质资源引进以及利用优良种质杂交育种造成不同地理来源的烟草种质遗传背景混合，而且不同国家使用的优良品种显示出类似的遗传背景；聚类结果显示烤烟材料并没有完全按照地域来源区分开，虽然烤烟材料来源于不同地域，但烤烟育种中使用的骨干亲本基本相似，美国优质品种都是直接或间接来源于Orinoco[2]，我国目前推广的种植品种绝大部分有美国品种亲源，因此不同地域来源的烤烟不能区分开；H.S.Moon等[15]发现微卫星等位基因位点数总体趋势是逐渐减少的，系谱法育种通过定向选择减少不利等位基因频率，有些等位基因也会因遗传漂变而丢失，这种育种实践中消极的一面就是导致现代种群内遗传变异大大减少，遗传变异水平较低或降低可能会限制潜在重要农艺性状的遗传改良。本研究与前人研究结果相同，烤烟品种之间的亲缘关系很近、遗传背景相似，存在遗传基础狭窄的问题。

3.3 对烤烟新品种选育的指导意义

目前育种工作主要是系统选育和杂交育种等方法进行，我国杂交育种过程中亲本选配通常使用国外引进的优质多抗品种以及国内推广优良品种。国内烤烟品种金星6007、净叶黄和红花大金元是我国育种中使用最多的亲本，由金星6007育成延烟1号、中烟14、革新3号、中烟15等品种，由净叶黄育成单育2号、中烟86、许金4号、庆胜2号等品种，由红花大金元育成中烟103、中烟104、南江3号、中烟101、云烟2号、辽烟11号、中烟9203等品种[21-23]；Speight G-28、K326和NC89等美国引进品种是我国主栽烤烟品种品质性状的骨干亲本，由G28育成云烟85、云烟87、云烟97、秦烟 1号、秦烟96、吉烟7号、中烟90、中烟98和G80等品种，由K326育成K346、RG17、贵烟 4 号、秦烟 95、中烟 201 和 KRK26等品种，由NC89育成的烤烟品种有贵烟11、秦烟1号、秦烟95、豫烟3号、中烟102等[23-24]。亲本组配除了国外引进品种与国内推广品种或地方品种外，还可以是我国南方烤烟品种与北方烤烟品种组配，中烟103是中国烟草遗传研究（北方）研究中心从红花大金元自然群体中获得变异株，经系统选育而成[25]；秦烟201是南方品种MS云烟97与北方品种秦烟96组配而成的雄性不育杂交种。育种过程中在亲本选配方面不仅要考虑亲本的地理来源，更要考虑亲本的遗传距离大小[26]。中国农科院烟草研究所以Speight G-28为母本，以抗赤星病品种净叶黄为父本进行杂交，育成中烟86[27]，本研究中Speight G-28和净叶黄之间的遗传距离为0.228，遗传距离较大；云烟2号是用红花大金元和Speight G-28杂交选育而成[28]，红花大金元和Speight G-28之间的遗传距离为0.220，遗传距离较大；云烟85与其姊妹种云烟87是用红花大金元与Speight G-28杂交选育的云烟2号和K326杂交，经系谱选择培育而成[29-30]，云烟2号和K326之间的遗传距离为0.158，遗传差异相对较小，是由于云烟2号的亲本之一是Speight G-28，而K326和Speight G-28的亲本都含有Coker 139的亲源。从主栽品种亲本来源可以看出，亲本使用集中、遗传基础狭窄是制约我国烤烟育种发展的主要因素。

3.4 结论

本研究中我国地方品种表现出较大的遗传差异，应深入研究地方品种性状，加大国内地方种质资源的发掘、利用，拓宽烟草遗传背景，烤烟育种亲本组配应选择遗传差异大的烤烟品种，比如国外引进优良种质与国内地方种质组配、国内优良种质与地方品种组配，这些地方种质提供了宝贵的基因库，为中国烤烟育种计划提供了宝贵的种质资源。因此，遗传差异研究为烟草品种改良、杂交育种的亲本选配和提高育种效率提供了理论依据。

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