宫颈癌及癌前病变中Ki-67、P16蛋白的表达差异及诊断价值

刘 峰， 张春霞， 张 莉， 于云英

胜利油田中心医院妇产科，东营 257000

宫颈癌是我国女性高发恶性肿瘤之一，预后差且近年来呈现低龄化趋势，严重威胁女性的生命健康[1]。宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染明显相关，机体感染HPV后宫颈上皮可发生明显恶性变，并逐渐由癌前病变转变为肿瘤[2]。早期诊断和筛查HPV感染对预防和早期诊治宫颈癌具有重要意义。因此，本研究通过检测宫颈癌及癌前病变组织Ki-67、多重肿瘤抑制基因P16蛋白的表达差异，探讨二者对宫颈癌及癌前病变的鉴别诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年8月至2016年8月我院收治的90例宫颈上皮内瘤变(CIN)和40例宫颈癌患者作为研究对象，选取患者的活检病理组织标本及其一般临床资料进行回顾性分析。入选标准：所有宫颈癌及CIN患者均经病理确诊；初次原发病例；术前均未行放疗、化疗、药物治疗或其他内分泌治疗。排除标准：急性感染；肝、肾、肺等严重器质性病变；非原发初诊；合并其他部位恶性肿瘤。患者术后均根据实际情况给予相应的对症治疗。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有入选患者及其家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色测定Ki-67、P16蛋白表达 活检病理组织标本进行常规石蜡切片处理，对所有切片进行免疫组织化学染色，染色前1 d进行脱蜡处理，抗原修复切片后采用75%、85%、90%和100%梯度乙醇水化，室温下3%双氧水浸润10 min，自来水流动冲洗3 min，然后采用纯血清封闭12 h，滴加兔抗人Ki-67、P16多克隆抗体一抗(冻干粉型，0.1 mL，美国Santa Cruz公司)后置于4℃孵育过夜。次日PBS冲洗后滴加兔抗人Ki-67、P16多克隆抗体二抗(冻干粉型，0.1 mL，美国Santa Cruz公司)，37℃恒温孵育60 min，PBS冲洗后加DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，镜下观察。阴性对照采用PBS处理代替一抗[3]。

1.3 免疫组化染色结果判定标准 采用双盲法判读并记录染色结果，所有切片均经2位经验丰富的病理专家单独读片判断。每张切片随机选取5个高倍镜(×400)视野进行结果观察，根据细胞及其标志物染色强度和着色率进行计数分析[4]。Ki-67表达判定标准：视野内无阳性细胞表达为阴性；阳性细胞分布少于视野1/3为低表达；阳性细胞分布占视野1/3～2/3为中等表达；阳性细胞分布占视野2/3以上为高表达，中等表达及以上为阳性表达[5]。P16表达判定标准：视野内无阳性细胞表达为阴性；阳性细胞分布不足视野25%为弱阳性；阳性细胞分布多于视野25%为强阳性[6]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，多组间比较采用方差分析，数据不符合正态分布或方差不齐则应用非参数检验，检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 两组患者基线资料及人口学特征的对比 40例宫颈癌患者年龄25～82岁，平均(53.24±4.53)岁。90例CIN患者年龄23～81岁，平均(52.46±4.26)岁。两组患者基线资料及既往史、妊娠史、过敏史、手术史等差异无统计学意义，具有可比性。

2.2 两组患者病变组织Ki-67、P16蛋白的表达差异 结果(图1、表1)表明：Ki-67和P16蛋白在宫颈癌及CIN病变组织中均有一定程度的表达。CIN组织Ki-67蛋白阳性表达率随病理分级的增高而明显升高，高级别CIN组织Ki-67阳性表达率明显高于低级别CIN(P<0.05)；宫颈癌组织Ki-67蛋白阳性表达率明显高于CIN病变组织(P<0.05)。

CIN组织P16蛋白呈阴性或局灶性表达，低级别CIN组织P16阳性表达率明显低于高级别CIN组织；宫颈癌组织P16蛋白阳性表达率高于CIN组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 免疫组化染色测定宫颈癌及CIN组织Ki-67、P16蛋白的表达

A: 低级别CIN组织Ki-67蛋白的表达，主要定位于细胞核；B:高级别CIN组织Ki-67蛋白的表达；C:宫颈癌组织Ki-67的表达；D: 低级别CIN组织P16的表达；E: 高级别CIN 组织P16蛋白的表达；F: 宫颈癌组织P16蛋白的表达. Original magnification： ×400

表1 宫颈癌及癌前病变组织Ki-67、P16蛋白的表达 n(%)

2.3 Ki-67、P16蛋白表达对宫颈癌、癌前病变的鉴别诊断价值 结果(表2)表明：Ki-67蛋白表达水平鉴别诊断宫颈癌与CIN的敏感性和特异性分别为0%、91.11%，P16蛋白表达水平鉴别诊断宫颈癌与CIN的敏感性和特异性分别为27.27%、100.0%。P16蛋白表达水平鉴别诊断宫颈癌与CIN的敏感性显著高于Ki-67，差异有统计学意义(P<0.05)。

Ki-67蛋白表达水平在区分低级别CIN与高级别CIN诊断的敏感性和特异性均为100.0%，P16蛋白表达水平在区分低级别CIN与高级别CIN诊断的敏感性和特异性分别为84.21%、80.00%，明显低于Ki-67蛋白，但差异无统计学学意义。Ki-67、P16蛋白联合鉴别诊断宫颈癌与CIN的敏感性明显优于单独诊断(P<0.05)，联合诊断在区分低级别CIN与高级别CIN的敏感性也明显优于单独诊断(P<0.05)。

表2 Ki-67、P16蛋白表达在宫颈癌及癌前病变的鉴别诊断价值 %

3 讨 论

Ki-67是一种与细胞增殖相关的核蛋白，正常生理状态下可在细胞周期的各个阶段表达，在异常的有丝分裂中，Ki-67呈明显的高表达[7]。机体Ki-67蛋白的表达水平与细胞群体的增殖能力明显相关，可反映正常生理情况下细胞的增殖活性，对判断病理情况下肿瘤细胞的异常激活及有丝分裂进程也具有一定的辅助作用[7]，被认为是宫颈上皮细胞鳞状分化及异常增殖的特异性标志物之一[8]。Ki-67蛋白除在正常宫颈鳞状上皮基底层表达外，在良性反应性增生与CIN病变中也有一定的表达。因此，在鉴别宫颈增生性病变时将其与其他抗体联合使用可提高诊断的特异性和敏感性。

P16又称多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS1)，是一个发现较早的抑癌基因，对多种肿瘤的转移有抑制作用，可与细胞周期蛋白D1发生特异性结合，从而竞争性抑制相关复合物的蛋白活性，阻断正常的细胞周期进程，与Ki-67共同参与细胞周期活动的调节[9]。宫颈癌前病变的诊断中P16强阳性提示宫颈有高度鳞状上皮内瘤样病变或宫颈癌的可能。P16在永生化的宫颈上皮细胞株中呈明显高表达，且在感染HPV的早期宫颈上皮细胞中即可检测到明显的P16异常表达，提示其对宫颈病变的早期诊断具有辅助价值[10]。

本研究结果表明，高级别CIN组织Ki-67蛋白阳性表达率明显高于低级别CIN(P<0.05)，宫颈癌组织Ki-67蛋白阳性表达率明显高于CIN组织(P<0.05)；高级别CIN组织P16蛋白的阳性表达率明显高于低级别CIN(P<0.05)，宫颈癌组织P16蛋白表达高于CIN组织(P<0.05)。P16在鉴别CIN和宫颈癌的敏感性高于Ki-67(P<0.05)，提示随着宫颈癌前病变级别的增高，P16表达强度明显增加。Ki-67和P16联合诊断在区分CIN和宫颈癌及低级别CIN与高级别CIN的敏感性均明显优于单独诊断(P<0.05)。因此，在宫颈细胞学中联合检测P16、Ki-67蛋白表达可以发现更多的高危病例，有利于减少患者的过度创伤性诊治，降低漏诊率。

综上所述，本研究结果表明Ki-67、P16的联合诊断能明显提高不同组织学分级CIN与宫颈癌的诊断敏感性，但相关结论仍有待进一步的大样本研究证实。

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