丝切蛋白1表达水平与原发性肝细胞肝癌患者预后的相关性

赵 瀛， 张春燕， 郭奕超， 戴 谦， 王蓓丽*， 郭 玮， 潘柏申，2

1. 复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，厦门 361015

原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，约占肝癌的80%，恶性程度高，患者生存率较低[1]。2016年的全球数据表明，肝癌发病率在所有恶性肿瘤中排名第4位，死亡率位居第2位[2]。目前HCC最有效的治疗手段仍然是手术。但HCC患者早期症状不典型，确诊时一般处于中晚期，基本丧失了手术机会或手术预后不佳。因此，寻找有效的早期诊断及预后判断生物标志物是HCC临床诊治的关键。

肿瘤转移是肿瘤致死的主要原因，在肿瘤早期就已存在，与肿瘤的基因编码改变有关[3]，且在病变极早期就可通过血行转移[4]，与肿瘤细胞动力密切相关。丝切蛋白1(cofilin 1)是一种肌动蛋白结合蛋白，能调控细胞伪足的形成过程，是调控细胞动力的重要环节，与胃癌[5]、前列腺癌[6]和乳腺癌[7]等多种肿瘤的预后密切相关。我们的预实验发现HCC患者循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)与HCC组织细胞中cofilin 1蛋白表达存在显著差异，提示cofilin 1蛋白表达与HCC预后相关。因此，本研究进一步探讨HCC组织cofilin 1蛋白表达水平与患者预后的相关性，为HCC的临床诊治提供新的研究靶标，改善患者预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年12月至2014年5月确诊为HCC，并于复旦大学附属中山医院接受肝癌切除术的126例患者作为研究对象。其中，男性101例，女性25例；年龄(54±11)岁，>50岁73例、小于或等于50岁53例，患者人口学特征及基线资料详见表1。根据所选病例手术切除标本病理号将其相应的石蜡包埋标本取出，挑选组织完整清晰的部分。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会审核批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色 HCC组织切片在二甲苯脱蜡、乙醇水化后，置于抗原修复液(50×EDTA 抗原修复液，江苏凯基生物技术股份有限公司)中微波修复9 min，3%过氧化氢溶液中浸泡15 min以抑制内源性过氧化物酶活性；PBS漂洗3次，5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min，加入小鼠抗人cofilin 1单克隆抗体(一抗，OriGene Technologies)，4℃孵育过夜。PBS代替一抗，作为空白对照。次日PBS 漂洗3 次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(二抗，工作液体积稀释比例为1∶5 000，OriGene Technologies)，室温孵育60 min。DAB显色液(福州迈新生物技术开发有限公司)显色8 min，苏木精对比染色20 s，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶固封。

表1 两组患者人口学特征及基线资料比较 n， N=126

AFP：甲胎蛋白；BCLC分期：巴塞罗那临床肝癌分组方案

1.3 染色结果判定标准 采用Pannoramic Viewer软件对细胞染色结果进行检测和半定量评分。细胞质内出现棕黄色颗粒，判断为cofilin 1阳性细胞。根据染色强度(强，3分；中，2分；弱，1分；无，0分)和阳性细胞百分率(4分，>80%；3分，51%～80%；2分，11%～50%；1分，≤10%；0分，无阳性细胞)的乘积计算总评分[8](图1)。总分8分及以上列为cofilin 1高表达组，未达8分则为cofilin 1低表达组。

图1 免疫组织化学染色评分标准(DAB染色)

A: 0分； B: 1分； C: 2分； D: 3分. Original magnification: ×160(基础图片), ×1 100(放大部分)

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0和GraphPad prism 6软件进行统计分析。采用Spearman相关分析法分析cofilin 1蛋白表达与HCC患者临床参数的相关性。采用生存分析法绘制无病生存(disease-free survival，DFS)与总生存(overall survival，OS)曲线图，探讨cofilin 1蛋白表达与HCC患者术后复发或生存相关性。采用Cox回归风险比例模型分析影响HCC患者在肿瘤切除术后生存与早期复发的独立危险因素，计算风险比(hazard ratio, HR)和95%可信区间(confidence interval，CI)。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 肝癌组织cofilin 1蛋白的表达 免疫组织化学染色结果(图2)表明：HCC组织cofilin 1高表达组35例；cofilin 1蛋白低表达组91例。

2.2 Cofilin 1蛋白表达与HCC患者临床参数的Spearman相关性 结果(表2)表明：cofilin 1蛋白表达评分与患者术前甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)水平、肿瘤大小及巴塞罗那临床肝癌分组方案(BCLC分期)正相关，差异有统计学意义(P<0.05)；而cofilin 1蛋白表达评分与术后AFP水平、术前术后γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, γ-GT)、谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、肿瘤包膜完整性和肝硬化及血管侵犯等临床指标无明显相关性。

图2 免疫组织化学染色测定肝癌组织cofilin 1蛋白的表达(DAB染色)

A: 肝癌组织cofilin 1蛋白高表达； B:肝癌组织cofilin 1蛋白低表达. Original magnification: ×160(基础图片), ×1 100(放大部分)

表2 Cofilin 1蛋白表达评分与HCC患者临床参数的Spearman相关性分析 N=126

AFP：甲胎蛋白；γ-GT：γ-谷氨酰转肽酶；ALT：谷丙转氨酶；BCLC分期：巴塞罗那临床肝癌分组方案

2.3 Cofilin 1蛋白表达水平与HCC患者术后复发的相关性 结果(图3)表明：cofilin 1高表达患者术后DFS明显短于低表达组，差异有统计学意义(P=0.000 1)。临床亚组分析结果表明：BCLC分期0/A期亚组(P=0.000 4)和肿瘤直径<5 cm亚组(P=0.000 1)中cofilin 1高表达患者术后DFS明显短于低表达患者；而AFP<20 ng/mL亚组(P=0.050 0)和未侵袭亚组(P=0.179 3)中cofilin 1高低表达患者术后DFS差异无统计学意义。

A：全组(P=0.000 1)； B： BCLC分期0/A期亚组(P=0.000 4)； C：肿瘤直径<5 cm亚组(P=0.000 1)；D：AFP<20 ng/mL亚组(P=0.05)； E：未侵袭亚组(P=0.179 3)

2.4 Cofilin 1蛋白表达水平与HCC患者生存情况的相关性 结果(图4)表明：Cofilin 1蛋白低表达组HCC患者术后OS明显长于高表达组患者(P=0.004 1)；临床亚组分析结果表明：BCLC分期0/A期亚组(P=0.001 3)和肿瘤直径<5 cm亚组(P=0.006 0)cofilin 1蛋白低表达组HCC患者术后OS时间明显长于高表达组患者(P=0.006 0)，而在AFP<20 ng/mL亚组(P=0.324 8)和未侵袭亚组(P=0.075 5)中差异无统计学意义。

2.5 HCC患者术后复发与生存的危险因素分析 Cox回归风险比例模型单因素分析(表3)发现：cofilin 1蛋白表达高低对患者术后复发有预测价值(P=0.025)，肝硬化、肿瘤直径大于5 cm、微血管侵犯和CTC高是预后不良的复发因素(P<0.05)；cofilin 1蛋白表达高低对患者术后生存也有预测价值(P=0.004)，肿瘤直径>5 cm及BCLC分期为B/C是影响术后生存的显著因素(P<0.05)。

多因素分析结果(表3)显示：cofilin 1蛋白高表达(HR=1.647，95%CI 1.015～2.672)、肝硬化(HR=2.044, 95%CI 1.133～3.688)、肿瘤直径大于5 cm(HR=1.989，95%CI 1.235～3.203)和高CTC(HR=1.795，95%CI 1.015～3.173)是导致HCC患者肝癌切除术后复发的独立危险因素；而cofilin 1蛋白高表达(HR=2.412，95%CI 1.696～4.940)和肿瘤直径>5 cm(HR=2.461，95%CI 1.367～4.429)是术后生存的独立危险因素。

图 4 Cofilin 1蛋白表达水平与各组HCC患者术后生存情况的相关性

A：全组(P=0.004 1)； B： BCLC分期0/A期亚组(P=0.001 3)； C：肿瘤直径<5 cm亚组(P=0.006 0)； D： AFP<20 ng/mL亚组(P=0.324 8)； E：未侵袭亚组(P=0.075 5)

3 讨 论

CTC作为肿瘤原发灶播散的“种子”，在肿瘤复发及转移的过程中发挥重要作用[9]。本课题组预实验发现，CTC可作为HCC诊断及预后的标志物；通过对CTC高与CTC低的两组HCC患者原发灶的表达谱芯片进行筛选，发现两组HCC患者cofilin 1表达差异显著，提示cofilin 1可能是导致CTC释放入外周血的关键分子，具有重大的研究价值及意义。因此，本研究旨在验证cofilin 1在HCC根治术后疗效监测和预后评估中的价值。

本研究入组了2012年12月至2014年5月于复旦大学附属中山医院接受肝癌切除术的HCC患者126例，对患者术后的组织芯片进行免疫组织化学染色，并对相关指标进行回顾性分析。结果发现，cofilin 1表达与患者术前AFP、肿瘤大小及BCLC分期相关。进一步利用Cox比例风险模型进行多因素分析发现：cofilin 1是HCC术后复发的独立预后危险因素；在一些低危亚组，如BCLC分期0/A期亚组和肿瘤<5 cm亚组中，cofilin 1高低表达的HCC患者发生肿瘤复发的差异仍有统计学意义(P<0.05)。本研究证实cofilin 1是良好的预后标志物，且在临床上对患者预后进行评估时，比BCLC分期及肿瘤大小更灵敏。

表3 HCC患者术后复发与生存的单因素及多因素风险分析

HR：风险比(hazard ratio)；95%CI：95%可信区间；AFP：甲胎蛋白；ALT：谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase)；HBsAg：乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen)；BCLC分期：巴塞罗那临床肝癌分组方案;TTR：复发时间(time to recurrence)；OS：总生存时间(overall survival)

Cofilin 1主要通过肿瘤转移过程中细胞动力增强、细胞分裂和细胞转化启动对肿瘤细胞起到调控作用[10]。Wiskott Aldrich综合征蛋白家族、肌动蛋白相关2/3复合体和肌动蛋白单体主导着突触形成的过程[11]，而cofilin 1对肌动蛋白单体起到关键的调控作用，提示cofilin 1是使肿瘤细胞从静止状态转变为运动状态的重要因素。

综上所述，在肝癌临床诊治中，cofilin 1可作为一个用来有效筛选具有较高复发风险患者的潜在指标，从而辅助临床采取相应措施，实施不同的治疗策略，制订个体化的医疗方案，实现精准医疗。在后续的研究中，本课题组会针对cofilin 1的上游调控因子及相应通路进行深入探索，并且进一步探讨cofilin 1与细胞运动相关的分子机制。

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