Notch信号通路在骨关节炎软骨细胞中的表达及意义

， ， ，，，，，邓月

(四川省骨科医院上肢科，四川 成都 610041)

Notch信号通路是高度保守的细胞间信号传导通路，广泛存在于无脊椎动物及脊椎动物中。Notch信号通路通过配体与受体结合激活，调控细胞的增殖、分化与凋亡，决定细胞的命运，与多种组织、器官、系统的发育及多种疾病密切相关[1-2]。目前证实哺乳动物有4个Notch受体(Notch1～4)和5个Notch配体(Delta1、Delta3、Delta4、Jagged-1、Jagged-2)。骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是最常见的退行性关节疾病，具有较高的发病率。有文献报道40岁以下人群的发病率约5%，60岁以上人群中高达50%的人在X射线上有OA表现，75岁以上人群中高达80%的人有OA症状[3-4]。OA晚期导致关节疼痛、畸形和功能障碍，严重影响患者的工作与日常生活，是成年人劳动力丧失的主要原因之一。我国骨关节炎患者可能超过5 000万[4]。Notch信号通路在OA软骨细胞增殖、分化、凋亡、基质合成及维持软骨细胞表型等方面起着十分重要的作用[1-2]。OA关节软骨中异常表达的Notch信号通路与其他OA致病因子共同作用于OA软骨及滑膜等组织，参与OA的整个病变过程[5-6]。但目前Notch配体及受体信号通路在OA中的作用地位及作用机制尚不明确，还需要进一步研究。

本文旨在通过细胞跨膜Notch配体4(delta-like ligand 4,DLL4)和γ-分泌酶抑制剂(DAPT)分别激活和抑制Notch信号通路后，观察体外培养的OA软骨细胞中Notch1、Notch3、Jagged-1、Jagged-2、HES5的表达情况，探索DLL与OA软骨细胞基质合成的关系及其可能的作用机制，从而探索Notch信号通路在骨关节炎病变进程中的作用及其可能的作用机制，为探索骨关节炎早期药物治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2017年我院8例因膝关节OA行膝关节置换患者的股骨髁软骨作为观察组，再选择1例因外伤行膝上截肢的正常股骨髁软骨作为对照组。收集患者一般资料，根据病史、X射线片、术中肉眼观察、术后镜下病理学等排除标本肿瘤、结核、感染、类风湿炎症、明显骨质疏松，同时排除有免疫系统疾病、糖尿病等全身性疾病患者。观察组8例，男2例，女6例，年龄57～85岁，平均68.1岁；左侧5例，右侧3例。对照组1例，男性，19岁。观察组及对照组取适量软骨组织块放入4%多聚甲醛固定，剩余部分放入DMEM低糖培养基等待细胞培养。培养液为无菌的DMEM低糖培养基(链霉素100 u/mL,青霉素100 u/mL)。细胞培养用100 ng/μL DLL4和20 μmol/L DAPT分别激活和抑制OA软骨细胞Notch信号通路，使用OA软骨细胞+PBS缓冲液作为对照。

1.2 细胞培养

1.2.1 原代培养 取剩余新鲜的软骨组织先后使用0.2%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型胶原酶低糖DMEM溶液、0.2%Ⅱ型胶原酶(sigma)溶液消化，再加入DMEM培养基(含20%胎牛血清，链霉素100 u/mL,青霉素100 u/mL)制成细胞悬液，转入培养皿中，再置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，一般4～6 h后软骨组织块消化完全。观察细胞生长情况，每3 d换液。

1.2.2 传代培养 原代培养细胞覆盖瓶底80%以上时，吸尽培养基，PBS清洗2次后加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃、5%CO2孵育箱消化2～3 min，镜下观察待大部分细胞变圆漂浮时，加入20%含胎牛培养基终止消化，1 000 r/min离心3 min后加入适量20%胎牛DMEM培养基重悬，血球计数板计数，104/mL传代接种进入传代培养。同时进行细胞爬片，Ⅱ型胶原免疫组化染色行细胞鉴定。

1.2.3 细胞爬片 盖玻片放置于培养皿中，无菌0.1 mg/mL多聚赖氨酸溶液包被盖玻片后干燥备用，待1代软骨细胞爬满培养瓶80%时，消化收集细胞，所收集的细胞按104～105/mL接种，隔夜待细胞贴壁后按分组加入实验药物，观察细胞生长情况，培养5 d后终止培养待细胞学检测。分组情况如下：①正常组(正常软骨细胞)；②OA组(OA软骨细胞+PBS缓冲液)；③DAPT组(OA软骨细胞+DAPT 20 μmol/L)；④DLL4组(OA软骨细胞+DLL4(DLL4)100 ng/μL)。

1.3 组织学检测

取材后软骨组织用4%多聚甲醛固定24 h后乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)脱钙，石蜡包埋后4 μm切片待组织学检查。分别使用HE染色、甲苯胺蓝染色观察软骨的形态变化。

1.4 免疫组化

免疫组化检测Notch-1、Jagged-1、Jagged-2、HES5、Notch-3在正常软骨细胞及OA软骨细胞中的表达情况。待1代细胞爬满培养瓶80%后，消化收集细胞，收集的细胞按104～105/mL接种于6孔板的盖玻片上，隔夜待细胞贴壁后按分组加入实验药物，培养5 d后终止培养，待下一步细胞学检测。实验步骤：培养5 d终止细胞培养，PBS清洗5 min，3次；4%多聚甲醛固定30 min；PBS清洗5 min，3次；3%H2O2(试剂A)孵育10 min；PBS清洗标本5 min，3次；山羊血清孵育(试剂B)37 ℃，30 min；相应的一抗孵育(滴度1∶200)4 ℃过夜，阴性对照滴加等量的PBS；PBS清洗5 min，3次；二抗工作液孵育37 ℃，30 min；PBS清洗5 min，3次；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液孵育30 min；PBS清洗5 min，3次；DAB显色，3～10 min；自来水冲洗；苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜观察、读片，记录实验结果。

1.5 Western blot蛋白印记技术

细胞培养及实验处理：OA软骨细胞培养瓶弃培养基，漂洗细胞2次，去尽残留培养基。加入1X SDS样品缓冲液(每孔100 μL，每瓶500～1 000 μL)，刮落细胞，转移到Ep管；蛋白裂解溶液的配制：Laemmli样品缓冲液950 μL，加入2-硫基乙醇50 μL，混匀；蛋白裂解：取收集的细胞，每 1X 细胞加入100 μL蛋白裂解液，反复吹打，使细胞充分裂解，样本经100金属浴变性，高速离心，-20 ℃保存。Western blot聚丙烯酰胺凝胶电泳：安装配好胶配制，定好分离胶位置，配制分离胶(12%)、浓缩胶，将已准备好的蛋白样品置于100金属浴中煮沸变形5 min，高速离心，备用。将配置好的胶放入电泳槽里，拔去梳子，加入电泳缓冲液，使之没过胶，用加样器吸取10 μL样品缓慢加入泳道，其中一空加预染的蛋白分子量Marker。将电泳装置与电源相连，恒压80 V 30 min，恒压110 V。蛋白膜转移：取出凝胶，去除浓缩胶成分，置于转膜缓冲液中，轻轻晃5 min，剪下与凝胶相同大小的PVDF膜，按梳子的齿列顺序用铅笔轻轻标记好泳道，甲醇中浸没10 s，然后放入转膜缓冲液中轻轻摇晃10 min。去除电泳转移夹，按阴极(黑色)、海绵垫、滤纸(3～4层)、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、阳极(红色)的顺序做好,注意PVDF膜上的序号应与胶的泳道相对应，凝胶和PVDF膜之间不要有气泡。放置好后置于转移槽中，加入足量的转膜缓冲液，使其完全浸泡在转膜缓冲液中，并在转移槽的四周用碎冰覆盖，接上电源，恒流240 mA,2.5 h。转膜结束，去除PDVF膜，TBS溶液洗3次(每次5 min)，凝胶可用考马斯亮蓝染色30 min，然后清水浸泡，观测转膜的效率。免疫杂交：将洗好的PDVF膜置于塑料盒中，加入适量的5%脱脂牛奶，置于摇床轻轻摇晃2 h。倒去封闭液，用TBS/T溶液洗3次(每次10 min)将膜置于封口袋，注意此过程戴手套，且尽量不用手接触PDVF膜，加入牛奶稀释的(浓度1∶1 000)的一抗，封口后置于摇床上室温缓慢摇晃孵育4～6 h或置于4 ℃过夜。将PDVF膜置于塑料盒中，TBS/T溶液洗3次，10 min。将膜置于封口袋，加入牛奶稀释的(浓度1∶5 000)辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔)，室温缓慢摇晃2 h。将PDVF膜置于塑料盒中，用TBS/T溶液洗3次(每次10 min)。化学发光法显带：配制ECL显色液配制，将显色液均匀地滴在PVDF膜上，使显色液与膜充分反应。将PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像仪成像。

1.6 评价方法

免疫组化结果评价方法：观察细胞染色强度A及阳性细胞率B。染色强度A得分方法：0(阴性)，1(弱阳性，轻度黄色，棕黄色颗粒)，2(中度阳性，棕黄色颗粒)，3(强阳性，棕褐色)。阳性细胞率B得分计分方法：0计为0分，≤25%计为1分，25%～50%计为2分，≥51%计为3分。AXB得分计为总得分0～9分，总得分0分计为阴性，1～2分计为弱阳性，3～8分计为中度阳性，9分计为强阳性。

Western blot蛋白印记技术结果评价方法：利用Quantity one分析软件，在考虑到内参蛋白的灰度值后，对目的条带的灰度值进行分析比较。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 OA软骨的HE及甲苯胺蓝染色

OA软骨HE染色，关节软骨表层粗糙，软骨细胞数量减少，软骨细胞固缩，排列紊乱，放射层部分软骨细胞集簇成团，软骨基质内可见空的软骨陷窝，基质染色深浅不一。OA软骨甲苯胺蓝染色，表面不整齐，排列紊乱染色深浅不一，放射层颜色较正常软骨组织浅。

2.2 Notch1、Notch3、Jagged-1、Jagged-2、HES5的表达

在正常软骨细胞组中，Notch-1呈弱阳性表达；Jagged-1、Notch-3呈阴性表达；HES5、Jagged-2有表达，但是很不明显(图1)。在OA软骨细胞组中，Notch1、HES5呈强阳性表达；Jagged-1、Jagged-2呈中度阳性表达；Notch-3呈弱阳性表达(图2)。在DAPT组软骨细胞中，Notch-1呈弱阳性表达，与OA组比较Notch-1表达量明显下调；Jagged-1仍呈中度阳性表达，较OA组染色变浅，表达量下调；Jagged-2呈强阳性表达，较OA组表达情况可能有上调或者不变；HES5仍呈强阳性表达，与OA组比较，HES5表达量下调；Notch-3仍呈弱阳性表达，较OA表达量下调(图3)。

在DLL组软骨细胞中，Notch-1染色深度明显加强，呈强阳性表达，与OA组比较Notch-1表达量明显上调；Jagged-1呈中度阳性表达，与OA组比较，Jagged-1表达量无明显变化；Jagged-2较OA组比较，染色明显加深，呈强阳性表达，表达上调；HES5仍呈强阳性表达，与OA组比较，染色变深，HES5表达上调；Notch-3仍呈弱阳性表达，与OA组比较Notch-3表达量无明显变化(图4)。

2.3 Western blot蛋白质印迹

免疫组化实验完成后，下一步Western blot技术半定量检测OA软骨细胞中Notch-1、Jagged-1、Jagged-2、HES5、Notch-3的表达情况。Nocth-1表达量：DLL组>OA组>DAPT组，OA软骨细胞中Notch-1大量表达，重组人Delta4蛋白干预后，Notch-1表达量显著上调，γ-分泌酶抑制剂DAPT干预后，Notch-1表达量明显下调，表达情况的变化与免疫组化结果类似。Jagged-1在DLL组以及OA组反应带着色相近，在DAPT组略有变浅并模糊，表明Jagged-1在OA软骨中大量表达，重组人Delta4蛋白干预后，Jagged-1表达含量未出现明显的下调或上调，γ-分泌酶抑制剂DAPT干预后，Jagged-1表达量有下调，这与免疫组化结果有相近之处。Jagged-2在3个组别中的反应条带未出现明显大的差异变化，免疫组化结果显示在OA软骨细胞组、DAPT组、DLL组中均成强阳性表达，Western blot检查结果与免疫组化结果基本相似。HES5表达量：DLL组>OA组>DAPT组，OA软骨细胞中HES5存在大量表达，重组人Delta4蛋白干预后，HES5表达量上调，γ-分泌酶抑制剂DAPT干预后，HES5下调，DAPT抑制HES5的表达。Notch-3的三个反应条带，PBS组与DLL组着色均模糊无明显差别，说明Notch-3在OA软骨细胞以及DLL干预后，表达量无明显变化，DAPT组无反应条带的出现，推测使用γ-分泌酶抑制剂DAPT干预，Notch-3明显下调，与免疫组化结果相似(见图5)。

a：Notch-1；b：Jagged-1；c：Jagged-2；d：HES5；e：Notch-3

a：Notch-1；b：Jagged-1；c：Jagged-2；d：HES5；e：Notch-3

a：Notch-1；b：Jagged-1；c：Jagged-2；d：HES5；e：Notch-3

图5 Western blot蛋白印迹

3 讨论

原发性OA的病因不明，发病与年龄、性别、职业、种族、肥胖、遗传等多种因素有关[4,7]。OA发病机制目前尚不明确，多种信号通路、基因、细胞因子、趋化因子、蛋白酶等参与OA的病变过程[8]，在软骨基质降解过程中存在着多种信号通路、基因、蛋白酶、细胞因子等生物学因素的参与。Notch信号通路在多种动物及人软骨发生、发育过程中表达并起着十分重要的作用[9]。Notch信号通路参与软骨的发生、发育，与软骨细胞的增殖、分化、凋亡密切相关[1,2,10-11]。Notch信号通路在OA软骨中的表达水平变化[6]，说明Notch信号通路可能密切参与OA的病变过程。既往报道显示Notch信号通路在对软骨基质的合成代谢和分解代谢都起着重要作用[10]。Mirando等[11]和Liu等[12]的研究均显示，丢失了Notch信号通路的关节软骨表现出类似于OA的病理过程，提示Notch信号通路在关节软骨的表型维持上是必不可少的。Notch信号通路作用十分广泛，除了经典的DNA结合蛋白(C-promoter-binding factor-1，CBF1)依赖的信号传导途径外，还存在独立CBF1的Notch信号传导通路[13-14]。研究表明Notch同时抑制DLX4基因的表达和促进TNFRSF10C的表达，而DLX4抑制细胞凋亡，TNFRSF10C促进细胞凋亡[5]。OA中软骨集簇细胞中较多细胞Notch表达阳性[15]。还有学者认为Notch信号高表达可能是软骨细胞表型改变的结果[5,15-16]。本组结果发现Notch信号通路表达水平在OA中发生变化，软骨细胞表型改变，Notch-1、Jagged-1、Jagged-2、HES5大量表达。γ-分泌酶抑制剂DAPT干预Notch信号通路后，抑制OA软骨细胞中Notch-1、HES5、Jagged-1、Notch-3的表达，对Jagged-2的表达作用不明显。重组人Delta4蛋白干预Notch信号通路后，促进Notch-1、Jagged-2、HES5的表达增加，对Jagged-1、Notch-3作用不太明显。

Karlsson等[5]发现Notch-1、Jagged-1和HES5在OA软骨中表达范围较正常软骨中的表达范围明显扩大。Notch1阳性率与OA软骨Outerbridge分级相关，随着软骨退变的加重，浅层及中层软骨细胞Notch1阳性率增高，深层软骨细胞Notch1阳性率降低。同时发现，基质金属蛋白酶13(MMP13)与OA软骨细胞HES5表达呈正相关，阻断Notch信号可以下调MMP13的表达。本实验证实γ-分泌酶抑制剂DAPT可抑制OA软骨细胞中HES5的表达，提示DAPT可通过MMP13途径改变软骨基质代谢。Karlsson等[17]又通过软骨培养发现Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-1、Jagged-2、Delta-1和Delta4在单层培养中表达。三维培养中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-1、Delta-1和HES5表达明显减少，并且无明确定位表达现象。Notch-2和Delta4在前7 d表达无明显下降，且在7～14 d时升高。最近一项研究同样显示Notch信号通路的另一重要配体HES1可以诱导MMP13等分解代谢因子[13]。Liu等[18]的实验证实Notch-1可分别于体内和体外独立激活包括IL-6在内的多种炎性因子参与OA病理过程。本次实验的DAPT与DLL均可对OA软骨中的Notch-1产生明显的作用，可能为潜在的治疗药物。

其他细胞因子也对Notch信号通路起调节作用，例如IL-1β和TNF-α抑制正常及OA软骨细胞Notch-3、Jagged-1、HES5的表达，其中IL-1β轻度抑制其表达，TNF-α明显抑制Notch-1表达。IL-1β明显增加Delta4的表达，TNF-α只轻度增加Delta4的表达[5]。本组结果显示，γ-分泌酶抑制剂DAPT能抑制Notch信号通路，Delta4蛋白能激动Notch信号通路，对软骨细胞基质代谢产生重要作用。Notch信号通路对OA的病理过程的影响十分复杂，具体作用机制还有待于进一步实验研究。

综上所述，Notch信号通路与OA软骨代谢密切相关，Notch信号通路可能对OA软骨细胞基质合成具有重要作用，弄清Notch信号通路作用机制，能为Notch信号的调节提供理论依据，有利于通过Notch信号通路的调控改善OA软骨细胞的代谢，减轻或延缓OA病变进展，为探索早期骨关节炎药物治疗提供理论依据。

[参考文献]

[1] Hardingham TE,Oldershaw RA,Tew SR.Cartilage,SOX9 and Notch signals in chondrogenesis[J].J Anat,2006,209(4):469-480.

[2] Karlsson C,Brantsing C,Svensson T,et al.Differentiation of human mesenchymal stem cells and articular chondrocytes:analysis of chondrogenic potential and expression pattern of differentiation-related transcription factors[J].J Orthop Res,2007,25(2):152-163.

[3] 周乙雄.骨关节炎——最常见的退行性关节疾病[J].中华关节外科杂志(电子版),2010,4(4):436-437.doi:10.3969/cma.j.issn.1674-134X.2010.04.001.

[4] 邱贵兴.骨关节炎流行病学和病因学新进展[J].继续医学教育,2005,19(7):68-69.doi:10.3969/j.issn.1004-6763.2005.07.020.

[5] Karlsson C,Brantsing C,Egell S,et al.Notch1，Jagged1 and HES5 are abundantly expressed in osteoarthritis[J].Cells Tissues Organs,2008,188(3):287-298.doi:10.1159/000121610.

[6] Geyer M,Grassel S,Straub RH,et al.Differential transcriptome analysis of intraarticular lesional vs intact cartilage reveals new candidate genes in osteoarthritis pathophysiology[J].Osteoarthritis Cartilage,2009,17(3):328-335.doi:10.1016/j.joca.2008.07.010.

[7] Loeser RF.Translational research in osteoarthritis-from molecules to animals to humans[J].J Musculoskelet Neuronal Interact,2008,8(4):301-302.

[8] 刘永刚,鲍隽君,邢自宝,等.骨性关节炎与细胞因子相关性研究进展[J].骨科,2010,1(2):105-107.doi:10.3969/j.issn.1674-8573.2010.02.020.

[9] 张衣北,陈安民,郭风劲,等.激活的Notch1信号系统抑制前软骨干细胞凋亡及其机制研究[J].中华小儿外科杂志,2006,27(11):592-595.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2006.11.010.

[10] Kohn A,Dong Y,Mirando AJ,et al.Cartilage-specific RBPjκ-dependent and -independent Notch signals regulate cartilage and bone development[J].Development,2012,139(6):1198-1212.doi:10.1242/dev.070649.

[11] Mirando AJ,Liu Z,Moore T,et al.RBP-Jκ-dependent Notch signaling is required for murine articular cartilage and joint maintenance[J].Arthritis Rheum,2013,65(10):2623-2633.doi:10.1002/art.38076.

[12] Liu Z,Ren Y,Mirando AJ,et al.Notch signaling in postnatal joint chondrocytes,but not subchondral osteoblasts,is required for articular cartilage and joint maintenance[J].Osteoarthritis Cartilage,2016,24(4):740-751.doi:10.1016/j.joca.2015.10.015.

[13] Oldershaw RA,Hardingham TE.Notch signaling during chondrogenesis of human bone marrow stem cells[J].Bone,2010,46(2):286-293.doi:10.1016/j.bone.2009.04.242.

[14] Martinez Arias A,Zecchini V,Brennan K.CSL-independent Notch signalling:a checkpoint in cell fate decisions during development?[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12(5):524-533.

[15] Hiraoka K,Grogan S,Olee T,et al.Mesenchymal progenitor cells in adult human articular cartilage[J].Biorheology,2006,43(3/4):447-454.

[16] Khan IM,Palmer EA,Archer CW.Fibroblast growth factor-2 induced chondrocyte cluster formation in experimentally wounded articular cartilage is blocked by soluble Jagged-1[J].Osteoarthritis Cartilage,2010,18(2):208-219.doi:10.1016/j.joca.2009.08.011.

[17] Karlsson C,Jonsson M,Asp J,et al.Notch and HES5 are regulated during human cartilage differentiation[J].Cell Tissue Res,2007,327(3):539-551.

[18] Liu Z,Chen J,Mirand AJ.et al.A dual role for NOTCH signaling in joint cartilage maintenance and osteoarthritis[J].Sci Signal,2015,8(386):ra71.doi:10.1126/scisignal.aaa3792.