特异性免疫指标在豚鼠头孢哌酮过敏死亡中的诊断价值

卢延旭 王飞虎 王 鹏 解 勋 王军威

（1 中国刑事警察学院法医学系 辽宁 沈阳 110035；2 桦甸市公安司法鉴定中心 吉林 吉林 132400）

1 引言

头孢类抗生素是目前临床上应用最广泛的抗生素类药物之一，有关该类药物严重不良反应的报告数量也连续两年排名首位[1]，其中最严重的不良反应是过敏性休克[2]。已有研究资料表明：头孢类药物的降解产物R1侧链为过敏反应的半抗原，其与蛋白结合形成完全抗原，引起严重的过敏性休克。据此，本研究成功建立了豚鼠头孢类药物过敏死亡模型，同时选取了I型变态反应中比较特异的类糜蛋白酶、类胰蛋白酶和TNF-α三项免疫学学指标，采用ELISA法和免疫组织化学的方法，考察了该3项指标在过敏死亡豚鼠死后0～72h内血清和组织中的水平或表达，为头孢类药物过敏死亡的法医学鉴定提供参考性诊断指标。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

实验试剂：注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠（哈药集团制药总厂，产品批号：A1502202-2）；牛血清白蛋白；PBS缓冲液；类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、TNF-α ELISA试剂盒（上海朗顿生物技术有限公司）；类糜蛋白酶一抗、SP试剂盒（博奥森生物技术有限公司）。

实验仪器：BIO-RAD MODEL 550酶标仪；LeicaAperioAT2高通量快速玻片扫描仪。

2.2 方法

2.2.1 豚鼠过敏死亡模型的建立

分组：健康清洁级远交系雄性豚鼠120只，体重在150～200g（由辽宁长生生物技术有限公司提供）。将上述120只健康豚鼠，随机分为2组，磷酸盐缓冲液（PBS）对照组40只、头孢菌素过敏死亡（实验）组80只。每组按时间点分4小组：死后即刻（0h）组、死后24h组、死后48h组和死后72h组，其中对照组每个时间点10只，实验组每个时间点20只。

过敏原的制备：称取牛血清白蛋白（BSA）1.2g溶于60mL 0.1M磷酸盐缓冲液（PBS）中，再加入头孢哌酮钠舒巴坦钠2.4g，之后用1mol/L NaOH溶液调节pH至10～11，于37℃水浴锅内放置120min，得到过敏原溶液。调节该溶液pH至7.5，于4℃冰箱冷藏备用。

给药：取上述过敏原溶液10mL，用PBS稀释5倍，作为致敏和激发溶液。于d1、d3、d5分别给每只实验组豚鼠腹腔注射0.5mL该溶液致敏，同步给每只对照组豚鼠腹腔注射等量的0.1M PBS溶液。d20给实验组豚鼠心脏注射上述过敏原溶液0.2mL/只，激发豚鼠过敏性休克，观察症状并记录死亡时间。同步给PBS对照组豚鼠心脏注射同容量的0.1M PBS溶液。颈动脉放血处死对照组豚鼠。死亡即刻组即0h组豚鼠死后立刻取血取组织，其他时间组豚鼠尸体4℃冷藏保存，并在各相应时间点取血取组织。

2.2.2 组织病理学观察与免疫学检测

HE染色：按死后各时间点提取实验组和对照组豚鼠的心、肝、脾、肺、气管、肾等组织，4%甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，常规HE染色，供组织病理学观察。

免疫组织化学（SP法）：采用SP试剂盒法，检测两组豚鼠死后第72h心、肝、肺、肾等多器官组织中类糜蛋白酶的表达。

ELISA采用ELISA试剂盒法，分别检测实验组和对照组豚鼠死后0～72h血清和肺、气管组织匀浆上清液中类糜蛋白酶、类胰蛋白酶、TNF-α的含量。

2.2.3 统计学分析

实验数据用SPSS 22.0软件处理，采用t检验分析。

3 结果

3.1 死前症状与HE染色组织病理学切片

80只健康豚鼠在心脏注射给药激发后，均出现竖毛、自发活动减少、行走不稳、对外界刺激反应迟钝等症状，继而呼吸困难、口鼻发绀、抽搐，二便失禁，最后死亡。有73只豚鼠在给药激发后10min内死亡，30min内实验组豚鼠全部死亡，死亡率100%。正常对照组40只豚鼠在观察期内均未出现异常症状。

解剖死亡豚鼠见多数豚鼠喉头水肿、肺脏淤血肿胀、气管内有粘液分泌。镜下见气管、支气管扩张淤血，心、肝、肺、肾等多器官淤血水肿（图1a、图2a、图3a、图4a），其中在肺脏中可见大量炎性细胞和嗜酸性粒细胞浸润（图3a）。对照组豚鼠均未见明显病理改变（图1b、图2b、图3b、图4b）。

图1 头孢菌素过敏死亡豚鼠心肌细胞改变

图2 头孢菌素过敏死亡豚鼠肝组织改变

图3 头孢菌素过敏死亡豚鼠肺组织改变

图4 头孢菌素过敏死亡豚鼠肾组织改变

3.2 免疫组化检测结果

与对照组相比，肥大细胞类糜蛋白酶在过敏死亡豚鼠肺和气管中大量表达。其阳性表现为肥大细胞胞浆及周边小范围内特异性棕黄色染色，主要分布于肺泡间质及肺小血管周围（图5a），以及气管粘膜下层疏松结缔组织中（图6a），而在对照组中未见类糜蛋白酶阳性表达（图5b、图6b）。在两组豚鼠心脏、肝、肾、脾等组织中均未检出类糜蛋白酶阳性表达。

图5 头孢菌素过敏死亡豚鼠肺组织中类糜蛋白酶阳性表达

图6 头孢菌素过敏死亡豚鼠肺气管中类糜蛋白酶阳性表达

3.3 ELISA检测结果

3.3.1 血清

与对照组相比较，实验组豚鼠死后即刻血清中类糜蛋白酶、类胰蛋白酶和TNF-α水平均显著升高。72h内，实验组豚鼠血清中类糜蛋白酶含量变化不大（见表1）；类胰蛋白酶在豚鼠死后48h内血清中的含量基本不变，在72h组过敏死亡豚鼠血清中，类胰蛋白酶含量有所下降，但与对照组相比仍有显著差异（见表2）；TNF-α在过敏死亡豚鼠血清中的含量呈下降趋势，72h已降至正常水平（见表3）。

表1 头孢菌素过敏死亡组血清中类糜蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表1 头孢菌素过敏死亡组血清中类糜蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 993±100* 875±183* 1029±195* 935±140*对照组 182±69 192±78 190±72 174±69

表2 头孢菌素过敏死亡组血清中类胰蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表2 头孢菌素过敏死亡组血清中类胰蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 1911±317* 2057±243* 2088±285* 1594±283*对照组 614±170 649±145 628±114 549±93

表3 头孢菌素过敏死亡组血清中TNF-α的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表3 头孢菌素过敏死亡组血清中TNF-α的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05；△为与对照组相比，P＞0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 179.952±51.476*130.642±36.635*78.479±29.872* 28.938±9.870△对照组 21.920±11.975 28.673±8.741 26.032±9.817 31.596±10.970

3.3.2 气管

与对照组相比，实验组豚鼠死后即刻气管中类糜蛋白酶、类胰蛋白酶和TNF-α含量均显著升高。类糜蛋白酶和类胰蛋白酶在过敏死亡豚鼠气管中72h内的含量基本不变（见表4、表5）；TNF-α含量呈下降趋势，但在72h时仍显著高于对照组水平（见表6）。

表4 头孢菌素过敏死亡组气管中类糜蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表4 头孢菌素过敏死亡组气管中类糜蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 616±138* 624±135* 592±118* 584±156*对照组 133±56 127±46 135±50 144±42

表5 头孢菌素过敏死亡组气管中类胰蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表5 头孢菌素过敏死亡组气管中类胰蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05

组别 0h 24h 48h 72h实验组 1627±297* 1556±318* 1504±298* 1434±301*对照组 472±146 402±122 437±123 417±112

表6 头孢菌素过敏死亡组气管中TNF-α的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表6 头孢菌素过敏死亡组气管中TNF-α的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05

组别 0h 24h 48h 72h实验组 162.370±46.834*131.116±33.335*99.573±28.958* 63.846±21.592*对照组 23.204±7.035 22.647±9.535 21.975±9.372 23.058±10.340

3.3.3 肺

与对照组相比，实验组豚鼠死后即刻肺组织中类糜蛋白酶、类胰蛋白酶和TNF-α含量明显升高。其中类糜蛋白酶在过敏死亡豚鼠肺组织中72h内的含量基本不变（见表7）；类胰蛋白酶含量在48h内保持稳定，实验组72h组肺组织中类胰蛋白酶含量略有下降，但和对照组水平相比仍有显著统计学差异（见表8）；TNF-α含量呈下降趋势，但在72h时仍显著高于对照组水平（见表9）。

表7 头孢菌素过敏死亡组肺组织中类糜蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表7 头孢菌素过敏死亡组肺组织中类糜蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 699±222* 744±189* 673±275* 669±211*对照组 139±49 142±56 121±52 124±43

表8 头孢菌素过敏死亡组肺组织中类胰蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表8 头孢菌素过敏死亡组肺组织中类胰蛋白酶的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 1730±259* 1688±282* 1647±230* 1514±277*对照组 639±185 627±172 649±225 587±176

表9 头孢菌素过敏死亡组肺组织中TNF-α的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

表9 头孢菌素过敏死亡组肺组织中TNF-α的含量变化（实验组n=20，对照组n=10,±s,ng/L）

注：⋆为与对照组相比，P＜0.05。

组别 0h 24h 48h 72h实验组 168.582±48.943*127.180±34.532*92.482±36.796* 51.428±18.039*对照组 24.530±10.873 23.409±10.247 22.977±11.817 26.056±12.643

4 讨论

本研究成功建立了豚鼠头孢类药物过敏死亡模型，并采用ELISA法和免疫组织化学法，考察了类胰蛋白酶、类糜蛋白酶和TNF-α等三项指标在过敏死亡豚鼠死后0～72h内血清、肺和气管中的含量或表达。因头孢类药物的过敏机制与Ⅰ型变态反应中肥大细胞、嗜碱性粒细胞的活化和脱颗粒有关，上述指标属于肥大细胞脱颗粒的产物。在以往的研究中[3-5]，均侧重于检测类胰蛋白酶、类糜蛋白酶等指标在血清中的含量，很少有学者研究这些指标在机体过敏死后组织中的表达或含量变化情况。TNF-α也是肥大细胞脱颗粒所释放的炎性介质之一，同时它又是重要的炎症瀑布反应的源头，参与了头孢类药物过敏死亡的过程。

ELISA检测结果显示，与对照组相比，类胰蛋白酶和类糜蛋白酶在实验组血清、肺、气管中含量明显升高（P＜0.05），且在豚鼠死后72h内，类糜蛋白酶含量基本保持不变，血清中类胰蛋白酶含量在72h组有所下降，但较对照组仍有显著统计学差异（P＜0.05）。该结果说明这两项指标在尸体中不易被分解，具有较高的稳定性。TNF-α在过敏死亡豚鼠血清、肺和气管中的起始含量较对照组明显增高，但呈下降趋势。在豚鼠死后72h，血清中TNF-α含量降至对照组水平（P＞0.05），而肺和气管中TNF-α含量与对照组相比仍有显著统计学差异（P＜0.05）。说明肺和气管中TNF-α不易被分解，同时也提示在实际检案中，血清中TNF-α含量应尽早检测。由于每项生物化学指标的含量变化都受到几种因素的影响，所以，建议综合运用上述指标，确保人头孢菌素类药物过敏死亡案件的鉴定结果正确无误。

类糜蛋白酶的免疫组织学观察结果表明：与对照组相比，过敏死后72h的豚鼠肺和气管中表达明显增多，而在心、肝、脾、肾等组织中未检见阳性表达，说明头孢类药物引起过敏性休克时主要损害器官是肺脏。本次免疫组化所用组织为豚鼠死后冷藏72h后所取，在肺和气管中仍检见高表达，说明类糜蛋白酶的活性在肺和气管组织中较稳定，不易受到腐败等因素的影响。提示类糜蛋白酶在过敏死亡机体肺和气管中的高表达，可以作为鉴定此类案件的一项较客观的依据。

上述研究结果提示，类糜蛋白酶、类胰蛋白酶和TNF-α在头孢类药物过敏死亡法医学鉴定中具有重要价值，可以作为头孢类药物过敏致死案件鉴定的参考性诊断指标。另外，本研究对组织中上述指标的含量或表达的考察具有重要实践意义。与以往重点检测相关免疫学指标在血清中含量情况相比较，组织中尤其是气管中的免疫学指标不易受腐败等因素影响，具有更高的稳定性和可靠性；在尸体血液已经丧失检验条件或者尸体已经被处理的此类案件中，采用免疫组织化学的方法考察肺和气管中类糜蛋白酶的表达情况具有重要诊断价值；采用免疫组化的方法对组织中免疫学指标的考察同样适用于冰冻组织或陈旧石蜡切片，为此类案件的重新鉴定或回顾性研究指明了方向。

本研究考察了过敏死亡豚鼠体内相关免疫学指标在0～72h内的变化情况，在此基础上，还需收集人头孢类药物过敏死亡的案例，进行上述指标的系统性考察。此外，在实际检案中，有很多尸体不能被及时检验，尚需增加考察人过敏死亡72h后，上述免疫学指标的变化规律。本实验豚鼠尸体保存条件为冷藏保存，有研究[6]表明保存尸体的条件会对尸体血清中IgE、类胰蛋白酶含量有影响，提示在高度怀疑人头孢类药物过敏死亡时，应对尸体尽早冷藏或冷冻保存并尽早进行尸体检验。

参考文献：

[1] 国家食品药品监督管理局.国家药品不良反应监测年度报告(2016年)[EB/OL].(2017-04-28)[2017-05-07].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0844/172167.html.

[2] 田艳平,朱燕,尹红,等.46例注射用头孢哌酮/舒巴坦致过敏性休克分析[J].中国药物警戒,2010(4):246-248.

[3] Horn K D, Halsey J F, Zumwalt R E. Utilization of serum tryptase and immunoglobulin e assay in the postmortem diagnosis of anaphylaxis[J]. American Journal of Forensic Medicine & Pathology,2004(1):37-40.

[4] 郭相杰.肥大细胞及其蛋白酶在药物过敏性休克法医诊断中的应用研究[D].太原:山西医科大学,2015:14-25.

[5] Zhou X, Whitworth H S, E-Khedr M, et al. Mast Cell Chymase:A Useful Serum Marker in Anaphylaxis[J]. Journal of Allergy &Clinical Immunology,2011(2):AB143-145.

[6] 米丽,高卫民,杜中波,等.大鼠过敏性休克死后血清IgE、类胰蛋白酶的变化[J].法医学杂志,2015(3):181-184.