HPLC法同时测定山豆根中4种生物碱及其含量

何超然，李 哲，李 任，王丽丽，沈 素，余俊先（首都医科大学附属北京友谊医院药学部，北京 100050）

山豆根为豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根及根茎, 具有清热解毒、消肿利咽的功效，内含多种苦参碱类生物碱成分[1-2]。苦参碱类生物碱是以苦参碱为代表、化学结构相似的一类生物碱，主要包括苦参碱（matrine，MT）、氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）、槐果碱（sophocarpine，SC）及N-甲基野靛碱（N-methylcytisine）等[3]。随着人们对苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究的不断深入，苦参碱在抗肿瘤方面的独特作用和广泛应用前景已引起人们的重视。苦参碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡，干扰细胞周期等不同作用机制，针对多类型多部位的癌症发挥作用[4-5]。本研究采用高效液相色谱法对广西等省份的山豆根提取物中苦参碱类生物碱成分进行测定，分析出不同产地、批次样品中成分的含量，为中药种植的规范化质量控制提供参考依据。

1 仪器和试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G1314A可变波长紫外检测器，G1322A脱气装置，G1310A Iso泵，G1313A自动进样器，Agilent chemStation色谱工作站；3-18K低温离心机（德国Sigma公司）；MS3 basic旋涡混合器（德国IKA公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂）；PHS-3E型pH计（上海雷磁仪器厂）；BS 124S电子天平（北京赛多利斯仪器公司）。苦参碱（批号：17061508，纯度HPLC≥98%）、氧化苦参碱 （批号：17061501，纯度HPLC≥98%）、槐果碱（批号：161013，纯度HPLC≥98%）、N-甲基野靛碱（批号：161115，纯度HPLC≥98%），以上标准品购自成都普菲德生物技术有限公司。甲醇为色谱纯（Merck医药生物科技公司），磷酸（国药集团化学试剂有限公司）、三乙胺（天津市福晨化学试剂厂）、磷酸二氢钾（北京市红星化工厂）均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取适量苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱及N-甲基野靛碱对照品，加甲醇分别配成含浓度为1 mg·L-1氧化苦参碱、1 mg·L-1N-甲基野靛碱、1 mg·L-1苦参碱、1 mg·L-1槐果碱的对照品储备液。精密吸取苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱及N-甲基野靛碱对照品储备液，加流动相配成浓度为0.1 mg·L-1氧化苦参碱、0.1 mg·L-1N-甲基野靛碱、0.1 mg·L-1苦参碱、0.1 mg·L-1槐果碱的混合对照品溶液。2.1.2 供试品溶液的制备[6]将来自不同省份的山豆根样品进行编号，分别为广西（G1、G2、G3、G4），四川（S1、S2、S3、S4）和江西（J1、J2、J3、J4）。进行洗药、润药、切药、干燥、粉碎等步骤，称量适量，煎煮、浓缩、醇沉，静置后取上清液，在沉淀中再加入45%乙醇，静置后再次取上清液，并与之前得到的上清液合并，回收乙醇，消毒后加入适量原辅料，静置吹干，得到样品粉末。分别取样品粉末5 mg溶于3 mL甲醇中，震荡3次，每次3 min，间隔10 min，使其充分溶解，使用低温离心机18 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用氮气吹干，加300 mL甲醇进行复溶，得到待测样品溶液。

2.2 色谱条件和方法学验证

2.2.2 线性范围 精密吸取各对照品储备溶液配成浓度为1、2、5、10、100、200、500、1000 μg·mL-1的对照品溶液，进样量20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，分别以苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、N-甲基野靛碱等碱类成分峰面积积分值为纵坐标（Y），进样浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（r）；各对照品的回归方程见表1，结果表明，各待测物在各自浓度范围内具有良好的线性关系。

2.2.3 精密度实验 精密吸取同一浓度的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积积分值并计算RSD。苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱及N-甲基野靛碱的RSD分别为0.92%、1.07%、1.16%、1.12%，表明仪器具有较好的精密度。

图1 HPLC色谱图Fig 1 The HPLC chromatograms

表1 4种生物碱成分的线性关系及线性范围Tab 1 Linear relationship and liner rangers of four constituents

2.2.4 重复性实验 取同一批次的山豆根样品粉末，按“2.1”项下方法配置成6份供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积积分值，计算成分含量及相对标准偏差。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱及N-甲基野靛碱的RSD分别为2.21%、2.04%、2.44%、2.17%，说明多次重复测定得到的结果偏差较小，具有较高的重复性。

2.2.5 加样回收率考察[16]精密称取已知含量的同一样品溶液6份，加入适量的苦参碱、氧化苦参碱、N-甲基野靛碱和槐果碱标准品震荡混匀，离心，按照“2.2.1”项下色谱条件进行含量测定，计算4种成分的回收率、平均回收率及RSD。4种待测成分的平均回收率在98.0% ～ 102.0%，RSD均小于4.0%，表明方法具有良好的准确度。详见表2。

表2 山豆根中4种成分加样回收率测定结果. n = 6Tab 2 The result of recovery test of four constituents in subprostrate sophora. n = 6

2.2.6 稳定性实验 取同一批次的山豆根样品粉末，按“2.1”项下方法配制成供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h依次进样，测定峰面积积分值，计算相对标准偏差。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱及N-甲基野靛碱的RSD分别为2.41%、1.96%、2.01%、1.99%，表明配制的供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3 样品含量测定

取各山豆根样品粉末，按“2.1”项下方法配置成供试品溶液，每个样品平行2份，按“2.2.1”项下色谱条件下依次进样测定，测得样品中苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱及N-甲基野靛碱含量，进行加和得出提取物中生物碱成分总量，结果见表3。

由以上分析可见,暴雨发生前大气层呈现热力和动力的不稳定的结构特征,垂直风切变较明显。暴雨期间水汽主要集中在900～500 hPa各层。

表3 不同批次山豆根4种生物碱成分含量. n = 12Tab 3 The contents of four alkaloid constituents of subprostrate sophora in different batches. n = 12

3 讨论

3.1 色谱柱的选择[3, 8, 16-17]

本实验考察了Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Agilent NH2柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）的分离效能，氨基柱测定出的样品峰形不好，柱长为150 mm时样品保留时间较短，四种苦参碱类成分分离效果不佳，结果表明使用Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）能够将各待测成分完全分开，基线平稳，专属性及成分峰形良好，因此确定该柱为实验用分离柱。

3.2 流动相的选择

参考相关文献[8,11,18-19]，分别使用乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水和甲醇-磷酸盐缓冲液等多种流动相系统进行检测并比较分离效能，结果表明，以甲醇-磷酸盐缓冲液为流动相，色谱图中各成分保留时间有一定间隔且色谱峰的峰形较好；通过优化流动相条件发现，流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（20 :80）时，4种待测成分能达到较好的分离效果且保留时间相对较短，有利于对样品中生物碱成分的定量检测，且加入1%三乙胺溶液可以有效的减少拖尾，各成分的对称因子适宜。同时配制不同pH（分别为5.3，5.8，6.0，6.3和6.8）的流动相并分别进行检测发现，pH =6.3时四种成分分离情况及峰形较好。故选择甲醇-磷酸盐缓冲液（20 : 80，加入1%三乙胺，缓冲液调pH为6.3）为流动相洗脱条件。

3.3 供试品溶液制备

本实验采用煎煮浸出法对样品进行处理，根据药物的性质加入适当的辅料，使中药提取物成颗粒状，对于称重溶解等步骤有所帮助。

3.4 分析方法的确定

通过对照品溶液的线性方程计算，各样品的线性范围满足样品检测，回归方程r值满足要求，线性关系良好。精密度考察结果显示，连续多次对混合对照品溶液进行定量检测，各成分峰面积的RSD均满足要求，说明仪器具有较好的精密度。重复性考察结果显示，连续多次对同一供试品溶液进行定量检测，得出各成分峰面积并分别计算得到RSD满足要求，重复性良好。稳定性考察中将一份配制的供试品溶液分别放置0 ～ 24 h，并在不同时间节点进行定量检测，分别计算峰面积的RSD，结果显示供试品溶液不会随放置时间而发生成分浓度变化，24 h内稳定性较好。加样回收率考察中同一供试品溶液加入适量对照品后，计算各成分的平均回收率及RSD，结果满足要求，说明方法具有较好的准确度。

3.5 样品含量分析

通过含量测定可以评估出不同产地的山豆根生物碱成分含量，有助于对山豆根进行生物碱成分质量评价和资源评估。本实验对来自广西、四川、江西三个省份的山豆根药材中苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和N-甲基野靛碱4种生物碱成分的含量进行测定，12个样品中苦参类生物碱成分含量高低不均。分析各生物碱成分含量可知，各生物碱成分总和相对较低，不同批次的山豆根药材中生物碱成分的质量分数之和具有较大差异，广西省样品中的苦参碱类生物碱成分含量较高，四川省样品含量较低。分别对生物碱成分含量进行分析可知，样品中氧化苦参碱含量相对较高，槐果碱及N-甲基野靛碱含量较低，各成分含量具有较大差异。以上结果表明，4种成分在不同批次的山豆根药材中的含量差异显著，因此需要对山豆根中的多种成分进行同步测定才能更加全面地反映样品的内在质量。在相关制剂制备时，也应统一药材的来源、产地等相关因素，控制制剂质量及其质量标准，以保证临床疗效。

综上，本实验成功建立了山豆根中4个生物碱样品的HPLC定性和定量分析方法，测定了不同产地山豆根中各生物碱的含量，该方法简便、快捷、准确、重复性良好，表明中药山豆根的主要生物碱成分因产地不同而存在明显的差异，为中药种植的规范化质量控制提供重要参考依据。

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