慢性乙型肝炎患者自身抗体与HBV基因分型及耐药突变相关因素研究

陈韧刚，鲁 艳，魏三舟，孙 飞，李 敏

(1.湖北省孝感市孝昌县第一人民医院检验科 432900;2.湖北省孝感市中心医院检验科 432100)

乙型肝炎是全世界常见的传染病之一，如今我国仍是感染乙型肝炎病毒(HBV)最多的国家，据统计有9 000万人感染HBV，其中的1/4发展成慢性乙型肝炎，与HBV感染相关的肝硬化和肝癌严重威胁患者的生命安全[1-2]。乙型肝炎患者的病程进展受多阶段、多因素综合影响，有研究表明乙型肝炎的发展与患者的自身免疫应答、肝细胞损伤和炎性反应有关。感染HBV的患者体内出现多种自身抗体，如抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝肾微粒体(LKM)等[3]。在肝炎患者治疗过程中，一些患者会出现耐药突变情况，这影响了治疗效果[4]。本研究主要选取慢性乙型肝炎患者，探讨其自身抗体与基因分型及耐药突变的相关因素的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年4月至2017年4月孝昌县第一人民医院慢性乙型肝炎患者216例，其中男164例，女52例，平均年龄44.6岁。纳入标准：患者诊断符合慢性乙型肝炎防治指南(2014年版)的标准。

1.2方法

1.2.1标本采集 患者入院次日清晨空腹采集静脉血3 mL，离心分离血清-20 ℃保存备用。

1.2.2标本检测 (1)自身抗体检测：ANA、ASMA和LKM检测采用间接免疫荧光法，待检血清起始稀释浓度为 1∶100，将稀释血清与生物载片共同孵育 30 min，洗涤后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人免疫球蛋白抗体孵育 30 min，洗片、封片后荧光显微镜观察结果。抗可溶性肝抗原/肝-胰抗体(抗SLA/LP)、抗肝细胞溶质抗原Ⅰ型抗体(抗LC-1)和抗线粒体抗体Ⅱ型(AMA-M2)采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，将待测血清1∶100稀释后加入印迹膜条，室温摇床30 min，洗膜后加酶标记二抗，室温摇床30 min，洗膜后显色10 min，终止观察结果。试剂盒购自德国(欧蒙)医学实验诊断有限公司。

(2)HBV基因分型检测：采用聚合酶链反应(PCR)和Taqman荧光探针技术(FAM 标记的B型特异性探针和HEX标记的C型特异性探针)同时检测标本基因B型和C型。

(3)耐药突变位点检测：HBV P区扩增在PCR扩增引物下完成，将扩增产物纯化处理后进行测序和基因分型、耐药突变位点检测。测序后突变应用BLAST、DNAstar GeneBank等软件来确定突变位点。主要对rt204、rt181、rt236等耐药位点进行分析。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件处理本研究所有数据，计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1自身抗体检测结果 216例患者自身抗体检测结果，见图1。216例患者中至少检测出1种的患者有89例，总阳性率为41.2%。其中以ANA阳性为主，有58例，以低滴度1∶100为主；LKM阳性13例；AMA-M2阳性12例；ASMA阳性7例；抗SLA/LP阳性3例；抗LC阳性4例。

图1 自身抗体检测结果

表1 自身抗体在两种基因型中分布

2.2HBV基因分型结果及自身抗体分布 HBV分型结果显示，216例患者中B型有30例(13.9%)，男18例，女12例；C型有186例(86.1%)，男128例，女58例。自身抗体在两种基因型中分布见表1。在自身抗体总阳性对比中，基因型B型和C型比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各种类型自身抗体比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3HBV P区基因逆转录酶区的序列突变及耐药情况 216例患者中共发现耐药突变的患者有39例，变异率为18.1%。各耐药相关位点突变基因型分布见表2。总耐药位点在两个基因型中分布差异无统计学意义(P>0.05)；各位点在两个基因型中分布差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各耐药相关位点突变基因型分布

3 讨 论

HBV感染后患者出现急性肝炎的可能性低，患者极易慢性化，随着慢性乙型肝炎的发展，患者逐渐转变成肝硬化，更严重的转变为肝癌[5]。HBV在感染患者的同时，也会通过多种反应来影响机体的免疫系统，损害机体的免疫耐受性，诱导发生自身免疫反应，加剧肝细胞损坏，使病情迁延不愈，增加治疗难度[6-7]。之前，关于慢性乙型肝炎患者出现自身抗体的报道较多，本研究结果显示，216例慢性乙型肝炎患者中自身抗体阳性的患者有89例，占41.2%，其中ANA阳性的最多，有58例，阳性率为26.9%，之后依次是LKM阳性13例；AMA-M2阳性12例；ASMA阳性7例；抗SLA/LP阳性3例；抗LC阳性4例。这说明，自身抗体的出现是造成慢性乙型肝炎患者肝细胞损伤的机制之一。故而慢性乙型肝炎患者检测自身抗体有助于治疗和对疾病的了解，还对探讨HBV致病机制具有十分重要的指导意义。

在我国，HBV基因型以B型和C型为主，不同的基因型，因基因的差异可造成致病性的差异，从而影响病情的发生、发展，以及自身机体的反应[8-9]。HBV基因型一直是乙型肝炎的研究热点，自身抗体在不同基因型的HBV患者中分布是否也有差别？本研究基因分型结果表明，B型HBV有30例患者，C型HBV有186例，自身抗体在两种基因型中的分布C型高于B型，但差异无统计学意义(P>0.05)，这表明自身抗体的出现与基因型可能没有关联，C型更容易产生自身抗体有待于证实。

在过去的报道中，HBV DNA可自然地发生耐药位点的突变，在使用抗病毒药物之后，通过免疫、药物和自然突变多种因素的影响产生耐药的HBV，这给治疗难度带来巨大的挑战。在治疗过程中对耐药位点突变进行检测，有助于评估药物疗效，从而更好地选择治疗方案和预防处理耐药问题[10]。本研究选取LAM耐药相关位点(M204I、M204V、L180M)和ADV耐药相关位点(N236T、A181T、A181V)，基因位点在B型和C型中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，与孙丽娜等[11]研究中M204V、N236T、A181T、A181V 4个位点在B型和C型中的分布存在差异，这可能是由于此次标本量较少所导致的，应增加患者例数再做分析。

综上所述，自身抗体与慢性乙型肝炎患者的病程发展有一定联系，不同基因型产生自身抗体和耐药位点突变在基因型中的分布须进一步进行研究。

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[10]谢巧灵，丛庆伟，吴凌虹，等．耐核苷(酸)类药物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P区耐药突变位点分析[J]．实用肝脏病杂志，2016，19(1)：60-63．

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