双波长法测定南瓜中直链与支链淀粉含量

李晓娟,李柱刚,王 珣,韩俊岩,赵 伟,赵 日,陆 杰

(1.黑龙江省农业科学院博士后科研工作站,黑龙江省农业科学院生物技术研究所, 黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室,黑龙江哈尔滨 150086; 2.黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所,黑龙江哈尔滨 150086; 3.黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院,黑龙江齐齐哈尔 161041)

南瓜属葫芦科蔓生草本植物,富含多种营养物质,具有很好的食疗保健功效,其中南瓜对糖尿病的预防作用最受瞩目。谭桂军[1]研究发现南瓜具有防治糖尿病的功效是几种成分共同作用的结果,熊学敏等[2]证实南瓜多糖具有降糖作用。南瓜中的淀粉属均一性多糖,包括直链淀粉和支链淀粉,有研究表明常吃富含直链淀粉的食物能降低机体对胰岛素的需求[3-4],这可能是南瓜具有降糖作用的原因之一。南瓜中直链与支链淀粉含量的比率,不仅是影响食用口感的关键,同时也是影响其功效的要素之一[5]。

传统的分光光度法为双波长比色法的发展奠定了基础。单波长法是通过测定直链淀粉及总淀粉含量进而得出支链淀粉含量的方法,准确度较低[6]。双波长比色法以同一样液为对象,以不同波长下吸光度差值为测定值,具有较高准确性[7]。双波长比色法常以马铃薯为标准品,目前已被广泛应用于高粱、木薯、山药、锥栗、青稞等农作物中直链和支链淀粉含量的同时测定[8-12]。但标准品和样品往往存在差异,比如南瓜与马铃薯的直链与支链淀粉紫外扫描光谱就有明显差异,这样测定结果就难免存在一定偏差。

因此,为了避免因对照品差异产生的偏差,本文以南瓜为原料,分离纯化直链与支链淀粉,采用双波长比色法测定了南瓜中直链与支链淀粉含量,并进行方法学验证。此方法的建立,可为研究南瓜淀粉理化特性提供基础,为促进我国南瓜资源的深度开发、利用提供保证。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜粉 市售;石油醚、正丁醇、异戊醇、盐酸、氢氧化钠、酒石酸氢钾、碘、碘化钾、无水乙醇等 均为分析纯。

UV-1601紫外可见分光光度计 日本岛津SHIMADZU;1-15台式离心机 德国Sigma;PB-10酸度计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;RE-52CS旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;GR-240 热空气消毒箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 南瓜粉的脱脂处理 采用索氏抽提器对南瓜粉进行脱脂处理。用滤纸将烘干后的南瓜粉包好,加入石油醚(沸程30～60 ℃)至索氏抽提瓶内2/3处,加热回流至溶液无色(8～10 h,65 ℃),干燥、粉碎后备用。

1.2.2 南瓜待测样品的制备 准确称取干燥脱脂的南瓜粉样品10.00 g于烧杯中,加入200 mL蒸馏水,65 ℃搅拌提取1 h,8000 r/min离心20 min分离提取液,将提取液浓缩至1/3,加入浓缩液2.5倍体积质量分数为95%乙醇搅拌均匀,静置过夜,分离沉淀物,并以无水乙醇洗去杂质,干燥后(40 ℃,8 h),即得南瓜待测试样。

1.2.3 南瓜直链与支链淀粉的分离与纯化 淀粉的粗分离参照Li等[13]的方法,得到粗直链和粗支链淀粉。将预先配制好的240 mL正丁醇饱和水溶液加入粗直链淀粉中,搅拌加热至溶液澄清后静置24 h(4 ℃)。混合液于4 ℃、4000 r/min条件下离心20 min,得沉淀物。按以上步骤重复3次后,沉淀物以无水乙醇洗去杂质并浸泡24 h,干燥(40 ℃,8 h)后即得纯直链淀粉。

在粗支链淀粉中加入20 mL正丁醇,加热搅拌至溶液澄清后静置48 h(4 ℃)。混合液于于4 ℃、4000 r/min条件下离心20 min,弃去沉淀物,将上清液按上述步骤重复纯化3次。将最终获得的上清液浓缩至原来的1/2,加入2倍体积无水乙醇,降温至4 ℃,收集沉淀物。将沉淀物溶解于200 mL 0.5 mol/L NaOH溶液后再次加入2倍体积的无水乙醇沉淀,收集沉淀复溶于200 mL蒸馏水后再次以2倍体积无水乙醇沉淀并洗去杂质,40 ℃干燥8 h,即得纯支链淀粉。

1.2.4 南瓜直链和支链淀粉纯度的表征 参照Gilbert等[14]的方法测定分离得到直链和支链淀粉的纯度。分别称取0.01 g直链和0.05 g支链淀粉各置于50 mL容量瓶中,分别加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液,加热使样品溶解,冷却后,各量取1 mL直链与支链淀粉溶液,调节溶液pH为3.5,并加入0.07 g酒石酸氢钾和0.5 mL碘试剂,蒸馏水定容50 mL,显色30 min,以碘溶液做空白,在500～700 nm范围内测定样品的最大吸收波长,并测定该波长下吸光度Amax,按下式计算样品的蓝值。

蓝值=4×Amax/c

式(1)

式中,c为样品质量浓度,mg/100 mL。

1.2.5 南瓜直链淀粉和支链淀粉标准曲线的制作 分别称取0.10 g南瓜待测样品、直链和支链淀粉,加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液,加热振荡至样品彻底溶解,蒸馏水定容100 mL,即得1.00 g/L南瓜淀粉样品、直链和支链淀粉标准储备液。准确量取1.00 g/L南瓜待测样品1.5 mL,并分别量取直链淀粉标准储备液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL,支链淀粉标准储备液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL于50 mL烧杯中,加入一定量蒸馏水,用0.1 mol/L盐酸调节溶液pH至3.5,加入0.5 mL碘试剂,容量瓶定容50 mL,配制成南瓜样品和标准工作液,以蒸馏水作空白,显色20 min,测定吸光度。

1.2.6 双波长比色法的方法学验证

1.2.6.1 精密度评价方法 按照1.2.5方法测定同一样品4次,计算样品含量平均值(x,以相对标准偏差(RSD)表征方法的精密度。

式(2)

1.2.6.2 准确性评价方法 精密量取实验纯化得到的直链和支链淀粉纯品,加入已知含量的样品中,按1.2.5方法测定混合样品含量,计算回收率以评价方法的准确性。

回收率(%)=(加入标品后含量(ng)-样品含量(ng))/加入标品量(ng)×100

式(3)

式(4)

式(5)

由下式计算检出限:

DL=k·s1

式(6)

式中,DL为检出限,mg/mL或%;s1为浓度或含量测定结果的标准偏差,mg/mL或%;k等于2或3。

1.2.7 单波长法测定南瓜样品淀粉含量 南瓜待测样品中总淀粉含量的测定参照GB/T5009.9-2003中酸水解法[16];直链淀粉含量的测定参照标准NY147-88的方法[17];支链淀粉含量通过计算总淀粉含量与直链淀粉含量的差值得出。

1.3 数据处理

每个样品设3个平行,测定结果以平均值±标准差表示。采用Excel软件进行统计分析,Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 南瓜直链和支链淀粉的蓝值

蓝值是表示淀粉与碘结合能力的重要指标,利用淀粉-碘复合物吸收峰存在的差异也可对直链和支链淀粉的纯度进行表征。由于构成直链淀粉的葡萄糖单元较多,约有800～1200个,所以直链淀粉的蓝值一般在0.8～1.2之间,直链淀粉-碘复合物的吸收峰在600～680 nm,实验分离纯化的南瓜直链淀粉的蓝值和最大吸收波长分别为0.874和645 nm;而支链淀粉的葡萄糖单元较少,约14～30个,所以支链淀粉的蓝值一般在0.08～0.22之间,支链淀粉-碘复合物的吸收峰在520～590 nm[5],实验分离纯化南瓜支链淀粉的蓝值和最大吸收波长分别为0.196和565 nm,表明纯化样品纯度较高。

2.2 直链和支链淀粉测定波长的确定

按1.2.5配制的高浓度直链和支链淀粉标准工作液显色后,在400～800 nm范围内扫描,将吸收曲线叠加绘制在同一坐标系里。采用等吸收点作图法选定直链和支链淀粉的测定波长分别为645、565 nm,参比波长分别为495、730 nm(图1)。

图1 直链和支链淀粉的测定波长和参比波长的确定Fig.1 The determination wavelength and reference wavelength of amylase and amylopectin

2.3 双波长比色法标准曲线的绘制

2.3.1 直链淀粉标准曲线 以直链淀粉浓度为横坐标,以645 nm为测定波长,495 nm为参比波长,二者吸光度差值为纵坐标绘制标准曲线(图2),其标准曲线方程如下:

图2 直链淀粉标准曲线Fig.2 Standard curve of amylose

y=0.3127x+0.0043

式(7)

该方程决定系数(R2)为0.9981,说明在直链淀粉浓度0.004～0.028 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 支链淀粉标准曲线 以支链淀粉浓度为横坐标,以565 nm为测定波长,730 nm为参比波长,二者吸光度差值为纵坐标绘制标准曲线(图3),y=4.4009x+0.0074,R2=0.9973,0.02～0.07 mg/mL范围内线性关系良好。

图3 支链淀粉标准曲线Fig.3 Standard curve of amylopectin

2.4 双波长比色法的方法学评价

2.4.1 精度分析 如表1所示,按质量百分含量计算,南瓜中直链淀粉占南瓜待测样品质量的21.64%,支链淀粉占南瓜待测样品质量的50.19%,实验中总淀粉含量为直链淀粉和支链淀粉含量的总和71.83%。周爱梅等[18]采用酸水解法测定三个南瓜品种淀粉含量为84.89%～86.48%。这可能是因为酸水解法无法排除天然糖分的影响,导致结果偏高。实验中,实验值的RSD均小于2%,说明该检测方法重复性良好,具有较高的精度。

表1 直链和支链淀粉含量及相对标准偏差(%)Table 1 The concentrations and relative standard deviations of amylase and amylopectin(%)

2.4.2 准确性分析 由表2可知,样品测定回收率的平均值在98.62%～99.42%之间,在可接受范围内,RSD分别为2.43%和2.67%,表明该分析方法准确度较高。

表2 样品回收率Table 2 Recovery rates of amylose and amylopectin from samples

2.4.3 检出限分析 直链和支链淀粉浓度及标准偏差如表3所示。根据1.2.6.3中公式(6)分别计算出直链淀粉的DL为0.0116 mg/mL,支链淀粉的DL为0.0644 mg/mL(k=2)。证明该分析方法可检测范围较大,实用性较强。

表3 直链和支链淀粉浓度及标准偏差Table 3 The concentrations and standard deviations of amylose and amylopectin

2.5 双波长法与单波长法的比较分析

如表4所示,单波长法测得南瓜待测样品的总淀粉含量为82.36%,明显高于双波长比色法71.83%,这可能是由于酸水解法虽然在处理过程中去除了可溶性糖类,但无法排除部分难溶的非淀粉性糖类对检测结果的影响。与双波长法相比,单波长法所得直链淀粉含量略高,一方面可能是由于支链淀粉干扰所引起的差异,另一方面该检测方法是针对稻米米质测定所采用的标准方法。两种方法所得支链淀粉含量差别较大,这可能是由于单波长法所得支链淀粉含量是由总淀粉含量和直链淀粉含量的差值计算所得,因此无法排除总淀粉含量和直链淀粉含量测定中的误差,从而导致测定结果的不同。

表4 不同方法测定南瓜总淀粉、直链和支链淀粉含量比较(%)Table 4 Comparison of starch,amylose and amylopectin content by different methods(%)

3 结论

首次实现了南瓜中直链和支链淀粉的分离与纯化。以南瓜中直链与支链淀粉为对照品,确立了南瓜样品中淀粉含量测定的双波长比色法,通过精度、准确性以及检出限分析证明该检测方法具有较高的准确性和稳定性。与单波长法相比,该方法更加高效便捷,此外,双波长法以吸光度差值为测定值,排除了不同参比液之间的误差,从而也提高了检测的灵敏度和结果的准确性。

[1]谭桂军. 南瓜多糖对糖尿病降糖作用的研究概况[J]. 天津药学,2006,18(1):50-53.

[2]熊学敏,石扬,康明,等.南瓜多糖降糖有效部位的提取分离及降糖作用的研究[J].中成药,2000,22(8):563-565.

[3]Chang Y,Yan X,Wang Q,et al. Influence of ultrasonic treatment on formation of amylose nanoparticles prepared by nanoprecipitation[J]. Carbohydrate Polymers,2017,157:1413-1418.

[4]Zhu J,Zhang S,Zhang B,et al. Structural features and thermal property of propionylated starches with different amylose/amylopectin ratio[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2017,97:123-130.

[5]李海普,李彬,欧阳明,等. 直链淀粉和支链淀粉的表征[J]. 食品科学,2011,31(11):273-277.

[6]杨有仙,赵燕,李建科,等. 直链淀粉含量测定方法研究进展[J]. 食品科学,2010,31(23):272-276.

[7]加列西·马那甫,景伟文,削合来提·再丁. 双波长法测定谷类和豆类作物籽粒中直链和支链淀粉的含量[J]. 新疆农业科

学,2010,47(3):564-556.

[8]范明顺,张崇玉,张琴,等. 双波长分光光度法测定高粱中的直链淀粉和支链淀粉[J]. 中国酿造,2008,27(21):85-87.

[9]石海信,郝媛媛,方怀义,等. 双波长法测定木薯淀粉中直链和支链淀粉的含量[J]. 食品科学,2011,32(21):123-127.

[10]王丽霞,李彬,杨事维,等. 双波长分光光度法测定新鲜怀山药中直链与支链淀粉的含量[J].食品工业科技,2015,36(5):292-295.

[11]吴仲,梁一池,陈诗强,等. 锥栗中直链和支链淀粉含量同时检测方法研究[J]. 食品与机械,2014,30(2):72-74.

[12]谭亮,董琦,耿丹丹,等. 双波长比色法测定不同产地和品种青稞中直链淀粉和支链淀粉的含量[J]. 食品工业科技,2015,36(2):79-84.

[13]Li X,Xia Y,Gao W,et al. Evaluation of three traditional Chinese medicine starches and potential application in health product industry[J]. Food Hydrocolloids,2014,40(40):196-202.

[14]Gilbert G T,Spragg S P. Iodi metric determination of amylose iodine sorption:BLUE value in methods in carbohydrate chemistry[M]. New York and London:Academic Press,1964.

[15]李海峰. 检出限几种常见计算方法的分析和比较[J]. 光谱实验室,2010,27(6):2465-2469.

[16]GB/T 5009.9-2003,食品中淀粉的测定[S].

[17]NY147-88,米质测定方法[S].

[18]周爱梅,杨慧,杨磊,等. 不同品种南瓜淀粉的理化特性对比研究[J]. 现代食品科技,2013,29(8):1784-1790.