柱前衍生高效毛细管电泳法分析不同黄酒的多糖组成

2018-05-01陈传平陈乃东陈红风

食品工业科技 2018年8期

陈传平,陈乃东,陈红风

(1.皖西卫生职业学院,安徽六安 237005; 2.皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安 237012)

黄酒,也称为米酒,是我国历史最悠久的传统酿造酒,也是世界三大古酒之一。黄酒的酒体丰满,酒味醇厚,酒性柔顺,并以其美妙的色泽、独特的滋味、丰富的营养和独到的保健功能而著称于世[1]。研究表明,黄酒中含有很多生物活性物质,其中的糖类是形成其独特的滋味及保健功能的重要成分之一[2-3]。黄酒中的糖类大部分是葡萄糖,还有一定量的果糖、低聚糖及多糖[4]。其中低聚糖、多糖[5]可以被肠道内的有益菌所利用,起到优化体内环境,调节胃肠道机能[6],促进维生素合成和矿物质吸收[7]的作用,黄酒多糖还有抗氧化、调节免疫的活性[8]。近年来对黄酒的相关研究大多集中于理化检测和发酵工艺等方面,对黄酒的生理功效和活性物质研究还停留在起步阶段,因此很有必要借助现代科学研究方法对其进行系统、深入的探究[9]。

HPCE分析法操作方便、精度高,同时可从图谱上直观的确定多糖的单糖组成及比例。为了深入探讨黄酒的多糖组成,同时为黄酒质量标准的构建提供理论依据,本实验选用3种类型黄酒为测试对象,分离其中多糖,用蒽酮-硫酸法测其多糖含量,通过采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-高效毛细管电泳(HPCE)法检测其中多糖的单糖组成,并加以比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丹阳黄酒5年陈甜型黄酒,江苏丹阳酒厂,批号:20161012;太湖之星1878 甜型黄酒,江苏张家港酿酒有限公司,批号:20160916;中粮清润3年陈半甜型黄酒,中粮绍兴酒有限公司,批号:20160925;女儿红半甜型黄酒,绍兴女儿红酿酒有限公司,批号:20160923;和酒5年陈半干型黄酒,上海石库门酿酒有限公司,批号:20161014;金枫花雕3年陈半干型黄酒,上海金枫酒业有限公司,批号:20161026;上海老酒8年陈半干型黄酒,上海石库门酿酒有限公司,批号:20160728;沙洲优黄紫醉金迷半干型黄酒,江苏张家港酿酒有限公司,批号:20160820;中粮工坊12年陈半干型黄酒,中粮绍兴酒有限公司,批号:20160629;孔乙己清爽型半干型黄酒,中粮绍兴酒有限公司,批号:20160923;单糖标准品:D-(+)-半乳糖(批号:ZY130922)、D-甘露糖(批号:ZY130910)、D-(+)-葡萄糖(批号:ZY130915)、D-果糖(批号:ZY130910)、L-(+)鼠李糖(批号:ZY130915) 上海紫一试剂厂;D-(+)-半乳糖醛酸(批号:BCBK3704V)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) SIGMA试剂公司;乙腈天津市光复精细化工研究所,色谱纯;三氟乙酸(TFA) 成都西亚化工股份有限公司,色谱纯;聚酰胺 60～100目,山东君鸿生物科技有限公司;其余试剂均为AR。

HPCE电泳仪凯奥科技发展有限公司;高速冷冻离心机国立实验设备研究所;双光束紫外可见分光光度计普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酒多糖的提取与纯化取每种黄酒各250 mL,14000 r/min冷冻离心5 min,减压蒸发至30 mL左右,上聚酰胺柱纯化(聚酰胺使用前在90 ℃的95%乙醇沸腾活化3次),上样后先以去离子水洗脱至洗脱液呈现明显颜色,再用无水乙醇冲聚酰胺柱,分别收集水洗脱液、醇洗脱液,冷冻干燥,称重,编号,冷藏备用。

1.2.2 黄酒多糖的含量测定精密称取醇洗部分冻干粉末1.0 mg,溶于5 mL去离子水,以葡萄糖为标准品,蒽酮-硫酸比色法[10]测定醇洗部分冻干粉末中多糖的含量,计算出黄酒中多糖的含量。

多糖含量(%)=D·E·F·V/W×100

式中，W为黄酒样品质量(mg);E为黄酒样品中葡萄糖浓度(mg/mL);D为稀释因素；F为换算因子；V为黄酒样品体积(mL)。

1.2.3 不同黄酒的多糖组成分析

1.2.3.1 单糖标准品的衍生化及标准曲线的绘制分别精确称取6种单糖标准品各10 mg,置于5 mL的具塞试管中,加入1.0 mL的去离子水,再依次加入0.3 mol/L的NaOH 1.0 mL、0.5 mol/L的PMP 1.0 mL,塞上瓶塞并固定,混匀,置70 ℃水浴30 min后取出,自然冷却后滴加0.3 mol/L HCl 1.0 mL中和,转入烧杯,100 ℃烘干后加入2.5 mL的去离子水复溶,滴加0.3 mol/L HCl至pH5.0,用2.5 mL四氯甲烷反应,再加2.5 mL氯仿萃取3次,水相-50 ℃冷冻干燥至恒重,残渣加水溶解,分别配制成0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL标准溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,HPCE分析,对峰面积和浓度进行线性回归分析,得回归方程(标准曲线)[11]。

1.2.3.2 多糖的酸解及柱前衍生化准确称取10种黄酒多糖(醇洗部分冻干粉末)各20 mg,置于5 mL的具塞试管中,分别滴加2 mL的0.05 mol/L的TFA,摇匀,塞上塞子,在110 ℃、103 kPa高压蒸汽灭菌锅内反应5 h,冷却后转入烧杯中,100 ℃烘干[12-13]。再用1.2.3.1同法衍生化,测定黄酒多糖的单糖组成。

1.2.3.3 电泳条件经过预实验,确定检测黄酒多糖中单糖的电泳条件为:350 mmol/L的硼酸的溶液(pH10.8),检测电压20 kV,紫外检测波长250 nm,石英的毛细管柱50 μm×100 cm,柱温25 ℃,压力进样时间10 s[14-15]。

1.3 数据处理

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,组内前后比较用配对t检验,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。检验结果以p<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同黄酒多糖的含量

由实验测得的标准葡萄糖溶液标准曲线见图1,以葡萄糖浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线,得回归方程为A=10.222C-0.0346,决定系数R2=0.9936,线性范围0.0l～0.08 mg/mL。

图1 葡萄糖溶液标准曲线Fig.1 The working curve of glucose solution

根据标准曲线,用同样操作方法测定黄酒多糖的含量。3种类型黄酒样品多糖的含量测定结果见表1。

表1 3种类型黄酒样品多糖含量Table 1 The polysaccharide content of 3 kinds of yellow rice

表1表明:甜型黄酒丹阳黄酒5年陈中多糖含量为0.0361%,太湖之星1878为0.2412%,两者差异极显著(p<0.01)。半甜型黄酒中,中粮清润3年陈多糖含量为0.1463%,女儿红黄酒为0.1457%,两者无显著性差异(p>0.05)。6种半干型黄酒中,金枫花雕3年陈多糖含量最高,为0.1644%,上海老酒8年陈最低,为0.0182%,两种黄酒与同型其他四种黄酒相比,均差异显著(p<0.05);和酒5年陈与沙洲优黄紫醉金迷、中粮工坊12年陈与孔乙己清爽型多糖含量均无显著性差异(p>0.05)。已有报道的保健酒中,“三七枸杞酒”多糖含量为0.0216%[16],“虫草酒”多糖含量为0.0179%[17],干红葡萄酒为0.0538%[18]等,10种黄酒除“上海老酒8年陈”外,多糖含量均高于以上几种保健酒。

从黄酒类型看,半甜型黄酒多糖的平均含量最高,为0.1460%,其次是甜型黄酒0.1387%,半干型最低,为0.0654%,组间差异显著(p<0.05)。有研究指出,黄酒的稳定性是相对的,黄酒成分复杂,在贮存过程中,其理化指标也随之不断改变,贮存温度、光照、煎酒温度和时间、酒精度、酸度和pH都对成品黄酒多糖的稳定性产生影响,黄酒在生产和贮存过程中拥有合理的理化指标、适宜的煎酒温度和时间、通风、避光、适温贮存,可以降低活性多糖的分解和损失,保证黄酒多糖的功能性和有效性[19],因此,黄酒多糖的含量可能与其酿造工艺及贮存条件等因素有关。

2.2 不同黄酒的多糖组成分析

2.2.1 6种单糖PMP衍生物的HPCE分离及标准曲线 6种单糖PMP衍生物混合溶液进行HPCE,得到较好的分离,结果见图2。混合标准液中各单糖PMP衍生物的流出顺序及保留时间依次为PMP 19.450 min、葡萄糖20.332 min、甘露糖21.433 min、鼠李糖22.018 min、果糖22.542 min、半乳糖24.433 min、半乳糖醛酸28.579 min,6种单糖的浓度与峰面积的回归方程如表2所示,其相关系数为0.9953～0.9987。

图2 6种单糖的电泳分离图谱Fig.2 The HPCE chromatogragh of the six standard monosaccharides注:0:PMP;1:葡萄糖;2:甘露糖; 3:鼠李糖;4:果糖;5:半乳糖;6:半乳糖醛酸。

表2 6种单糖电泳标准曲线的线性方程与相关系数Table 2 Linear equation and correlation coefficient of 6 kinds of standard curves of monosaccharides electrophoresis

2.2.2 10种黄酒多糖单糖组成的HPCE分析 10种黄酒多糖单糖组成的HPCE分析图谱见图3。从检测结果中可以看出,不同种的黄酒多糖的单糖种类有所不相同。其中,甜型黄酒的丹阳黄酒5年陈及太湖之星1878、半干型黄酒的和酒5年陈及上海老酒8年陈有2个单糖衍生物色谱峰;其余6种仅有1个单糖衍生物色谱峰。根据单糖混标色谱图(图2)与不同黄酒多糖色谱图的出峰时间进行指纹图谱比较得出:丹阳黄酒5年陈、和酒5年陈和上海老酒8年陈的2个单糖衍生物色谱峰为葡萄糖色谱峰和甘露糖色谱峰;太湖之星1878的2个单糖衍生物色谱峰为葡萄糖色谱峰和果糖色谱峰;其余6种含有的1个单糖衍生物色谱峰为葡萄糖色谱峰。因此,10种黄酒多糖中,丹阳黄酒5年陈、和酒5年陈和上海老酒8年陈含有葡萄糖和甘露糖,太湖之星1878含有葡萄糖和果糖,其余6种含只有葡萄糖。与张艳芳等[20]报道的“赤霞珠”干红葡萄酒中多糖的单糖分析相比,10种黄酒多糖的单糖组成种类较少。同样,从本实验结果看,黄酒多糖的单糖组成与黄酒类型无相关性。

图3 10种黄酒多糖的单糖HPCE图谱Fig.3 Monosaccharide HPCE spectra of 10 yellow rice wine polysaccharides

2.2.3 10种黄酒多糖的单糖组成比例分析通过HPCE得到的10种黄酒多糖的单糖组成图谱与图1对比,可知其多糖的单糖组成成分很接近。三种类型黄酒多糖中除主要含有葡萄糖外,甜型黄酒的“丹阳黄酒5年陈”还含有3.85%的甘露糖,“太湖之星1878”含有17.833%的果糖;半干型中的“和酒5年陈”及“上海老酒8年陈”分别含有1.64%及14.578%的甘露糖。报道指出,葡萄酒中的多糖来源于葡萄浆果、酵母以及感染灰霉病的葡萄浆果由灰霉菌分泌的糖苷[21],形成多糖的多样性,不同黄酒多糖的单糖组成也可能与其不同的酿造原料、配方及工艺等因素有关。

表3 10种黄酒多糖中单糖的组成及其含量Table 3 Compositions and content of monosaccharide in the 10 kinds of rice wine polysaccharides

3 结论

不同类型及不同品种的黄酒多糖含量有明显差异,其多糖的单糖组成也有所不同。甜型黄酒多糖含量为0.0361%～0.2412%,平均含量为0.1387%;半甜型黄酒多糖含量为0.1457%～0.1463%,平均含量0.1460%;半干型黄酒多糖含量为0.0182%～0.1644%,平均含量0.0654%。10个品种中,“太湖之星1878”中多糖含量可达0.2412%,“上海老酒8年陈”仅为0.0183%,但大部分黄酒的多糖含量均高于其他保健酒。黄酒多糖的单糖组成以葡萄糖为主,部分含有少量的甘露糖及果糖。黄酒多糖含量及单糖组成可能与其酿造工艺及贮存条件有关,因此,尚需进一步进行动态跟踪研究。

本实验从黄酒中提取多糖用柱前衍生化的方法,再采用HPCE技术进行分析,测定结果可为不同黄酒多糖的组成及其含量的测定提供参考依据,也助于加深对黄酒营养保健功效的认识,为黄酒的生产工艺控制和新品研发提供科学依据。

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