陈皮总黄酮提取及抑菌活性初探

王慧芳,邵圣娟,王 曼,孟戎茜,郭月艳,郑佳楠,卫静莉

(太原工业学院化学与化工系,山西太原 030008)

陈皮又名橘皮,分布于长江以南各地区,药材分“陈皮”和“广陈皮”,含有挥发油、橙皮甙、维生素B、C、E等营养成分[1-2]。陈皮中的黄酮类化合物主要有橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和桔皮素等[3],具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤等作用,不但可用于降低胆固醇、预防动脉粥样硬化等,还可作为保健因子添加到饲料和食品中,因此,从陈皮中提取黄酮类物质已成为人们研究的热点[4-6]。目前,国内外学者提取陈皮黄酮方法主要有溶剂热法、酶法、超声、微波辅助法[7-8]等,其中,微波提取法因速度快、能耗低、溶剂用量少、选择性高、污染小等优点而成为生物提取的有效方法之一[9]。陈皮的提取对象主要集中在橙皮苷、川陈皮素、多甲氧基黄酮等,都存在溶剂用量大、提取温度高等问题,如:黄智等[10]比较了超声法和微波辅助法提取陈皮中橙皮苷的工艺条件,两种最佳工艺中的料液比均为1∶50 g/mL,逄显娟等[11]采用溶剂热法提取陈皮中橙皮苷的料液比为1∶70 g/mL,提取温度为120 ℃。另外,科研工作者们还对陈皮黄酮的抗氧化性活性进行了较为全面、深入的研究[12],而其抑菌性能方面的研究则相对较少。

响应面法是目前常用的一种数据处理、分析方法,广泛应用于生物、化工、医学等领域[13-15]。本实验采用BBD法优化了陈皮黄酮的微波提取工艺,从5种大孔树脂中筛选出适宜的树脂对陈皮粗提液中的总黄酮进行分离提纯,并对纯化后的黄酮进行抑菌活性研究,系统考查陈皮总黄酮的提取与抑菌活性,以期为深入研究陈皮黄酮产品的开发利用提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

陈皮 安徽省豪州市购于太原万民药房;芦丁标准品，纯度≥98% 上海金穗生物科技有限公司;茶多酚，纯度≥98% 今品化学技术(上海)有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、浓盐酸等，均为分析纯 天津化学试剂厂;HP-20、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-Ⅱ型大孔树脂 郑州华溢有限公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Tpb55菌株 中国普通微生物菌种保藏管理中心;金黄色葡萄球菌株(Staphylococcusaureus)ATCC26112 中国医学菌种保藏中心。

XH-100A型微波催化合成/萃取仪 北京祥鹄科技;FA-2104型电子天平 上海舜宇恒平;722S型可见分光光度计 上海棱光;HHW-4-数显恒温水浴锅 常州丹瑞;THZ-82恒温振荡仪 国华企业;DHP-9082型电热恒温培养箱 上海雷韵仪器;LDZX-30KBS型高压蒸汽灭菌锅 上海申安。

1.2 实验方法

1.2.1 陈皮黄酮的提取 将陈皮干燥、粉碎、过筛(50目)后,秤取0.5 g陈皮粉加入到一定体积浓度的乙醇溶液中,室温下静置30 min,在一定温度下微波辅助提取一定时间后,抽滤,得黄酮粗提液。提取液经旋转蒸发仪于50 ℃下蒸出溶剂后,在30 ℃的恒温干燥箱中干燥1 d得干品。

1.2.2 黄酮含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制 按姜昭等[16]的方法:绘制芦丁标准曲线,回归曲线方程为:y=8.517x+0.0062,R2=0.9992。

1.2.2.2 黄酮含量的测定 按标准曲线的方法测提取液的吸光度,并计算其含量。黄酮得率的计算见式1:

式(1)

1.2.3 单因素实验 以黄酮得率为标准,考查微波功率、乙醇体积浓度、料液比、微波时间、提取温度等五个因素对陈皮总黄酮得率的影响,每组实验平行三次,取其平均值。

1.2.3.1 微波功率的筛选 取0.5 g陈皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,静置30 min后,水浴加热至50 ℃后,微波功率分别为:300、400、500、600、700、800 W,微波提取3 min,考察微波功率对陈皮黄酮得率的影响。

1.2.3.2 乙醇浓度的筛选 取0.5 g陈皮粉于不同乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)溶液中,料液比(g/mL)1∶10,水浴加热至50 ℃后,微波功率600 W,微波时间3 min,考察乙醇浓度对陈皮黄酮得率的影响。

1.2.3.3 料液比的筛选 取0.5 g陈皮粉于60%的乙醇溶液中,不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) g/mL,静置30 min后,水浴加热至50 ℃后,微波功率600 W,微波提取3 min,考察料液比对陈皮黄酮得率的影响。

1.2.3.4 微波时间的筛选 取0.5 g陈皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,静置30 min后,水浴加热至50 ℃后,微波功率600 W,微波提取1、2、3、4、5、6 min,考察微波时间对陈皮黄酮得率的影响。

1.2.3.5 提取温度的筛选 取0.5 g陈皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,静置30 min后,水浴加热至不同温度(30、40、50、60、70 ℃)后,微波功率600 W,微波时间3 min,考察提取温度对陈皮黄酮得率的影响。

1.2.4 BBD实验 根据单因素实验结果,选取对陈皮黄酮得率影响较显著的微波功率(A)、微波时间(B)、提取温度(C)、液料比(D)四个单因素变量,进行四因素三水平BBD实验设计,设计因素及水平见表1。

表1 BBD实验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of BBD experiments

1.2.5 陈皮黄酮的纯化 将HP-20型树脂按崔蕊静等[17]的方法预处理操作后,在上样液pH=3.5、上样液流速为2 mL/min、上样液浓度为0.4 mg/mL、洗脱流速 2 mL/min、洗脱液乙醇体积浓度60%的条件下,对陈皮黄酮提取液进行吸附、解吸实验,重复三次,计算纯化后的陈皮黄酮干品。并按朱孔岳等[13]的方法,将纯化后的陈皮黄酮干品与粗提物干品均配成1 mg/mL的溶液,在λ=510 nm处测定其吸光度,对照芦丁标准曲线确定其纯度。相关计算公式见式2:

式(2)

1.2.6 抑菌活性测试

1.2.6.1 菌种的扩培 用移液枪分别移取1 mL大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌种原液,注入50 mL BPDA培养基中,于30 ℃恒温培养箱中培养12 h后冷藏备用。

1.2.6.2 抑菌活性实验 纯化后的陈皮黄酮干品与茶多酚均以95%乙醇为溶剂配制成不同浓度的溶液,采用滤纸片法[19]测试其抑菌活性,并设置无药空白对照,以消除溶剂对测试结果的干扰,每组平行做3组,取平均值。在30 ℃恒温培养箱中培养72 h后取出,用游标卡尺十字交叉测两次抑菌圈直径,取其平均值。抑菌圈直径的测量方法见式3:

抑菌圈直径=抑菌圈外径-滤纸片直径

式(3)

1.3 数据分析

采用Origin 7.0和SAS 9.2软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 陈皮黄酮提取的单因素实验

2.1.1 微波功率的筛选 由图1可知,随着微波功率的增大,微波的离子传导作用增强,分子热运动逐渐加强,陈皮的细胞膜被逐步破坏,黄酮浸出率增大,黄酮得率随之增大,在微波功率600 W时达到最大。当功率再增大时,强烈的热效应会造成黄酮的分解[20],从而导致黄酮得率下降,故选择微波功率为600 W。

图1 微波功率对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the yield of flavonoids

2.1.2 乙醇浓度的筛选 由图2可知,陈皮中总黄酮得率随乙醇浓度的增加而先增大后减小。原因在于:乙醇的极性与黄酮接近,随着乙醇体积浓度的增大,陈皮黄酮逐渐被溶出,到乙醇浓度为60%时达到溶解平衡,黄酮得率最大1.21%。而当乙醇浓度继续增大时,溶液渗透压也随之增大,其它杂质也会相继溶出,导致黄酮得率迅速下降,故选择乙醇体积浓度为60%。

图2 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol volume on yield of flavonoids

2.1.3 料液比的筛选 由图3可知,陈皮中总黄酮的提取得率随料液比的变化规律也是先增大后减小。原因在于:随着乙醇用量的增加,溶剂的传质动力也随之增加,有利于黄酮类化合物的溶出,当料液比为1∶20 g/mL时达到溶解平衡,黄酮得率最大。而当乙醇的量继续增大时,其它杂质也会相继溶出,导致黄酮得率迅速下降,且溶剂量过大也会给后处理带来负担,故选择料液比为1∶20 g/mL。

图3 料液比对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of material liquid ratio on yield of flavonoids

2.1.4 微波时间的筛选 由图4可知,随着微波提取时间的增加,微波的离子传导作用以及分子热运动逐渐加强,陈皮的细胞膜被逐步破坏,黄酮浸出率增大,在微波时间为3 min时达到最大,说明此时的陈皮黄酮已溶出完全。当微波时间再增加时,过量的分子热运动和离子传导作用会导致黄酮的分解,得率下降,故选择微波提取时间为3 min。

图4 微波时间对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave time on yield of flavonoids

2.1.5 提取温度的筛选 由图5可知,适当的升高温度有利于破坏陈皮的细胞膜,提高陈皮中黄酮的浸出率,因此,总黄酮得率随着提取温度的升高而逐渐升高,在温度为60 ℃时达到最高值,而当温度过高(即超过60 ℃)时,会使溶出的黄酮结构发生变化,从而导致黄酮得率下降,故选择提取温度为60 ℃。

图5 提取温度对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of temperature on yield of flavonoids

2.2 BBD实验

2.2.1 BBD实验设计与结果 基于表1响应面设计进行的响应面实验结果见表2。通过Design expert 8.0.5软件进行响应面分析后得到以黄酮得率为响应值的回归方程:

表2 BBD实验设计结果Table 2 The design and results of BBD experiments

Y黄酮得率(%)=1.34+0.016A+0.012B+0.023C+0.043D+0.031AB+0.049AC+0.039AD+0.016BC+0.022BD+0.024CD-0.21A2-0.10B2-0.098C2-0.095D2

表3 回归方程各项的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

两因素交互作用响应面图见图6。由图6的等高线图可以看出,微波功率与微波时间、微波功率与提取温度以及微波功率与料液比之间的交互作用图均为椭圆形,说明此三组交互项的交互作用显著[12],且微波功率与提取温度的交互作用比另两组的交互作用更明显,与表3中的模型显著性结果一致。另外,响应面图和等高线图均在所选范围内存在最高点,即极限值。

图6 两因素交互作用的响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of four factors interaction

2.2.3 最优条件验证 经BBD实验预测的最优条件为:微波功率619.30 W、提取时间3.12 min、提取温度61.84 ℃、料液比1∶21.42 g/mL,此条件下陈皮黄酮得率最高为1.3575%。根据实际实验水平，将反应条件修正为功率619 W、提取时间3 min、提取温度62 ℃、料液比1∶21 g/mL,乙醇体积浓度60%,重复3次,取其平均值,黄酮得率为1.3468%±0.0142%,与预测值的偏差仅为0.0107%,进一步证实该模型方程与实际拟合良好。

2.3 抑菌活性测试结果

由表4可知,纯化后的陈皮黄酮在浓度为1和0.5 mg/mL时对三种被测菌株均有不同程度的抑制作用,尤其是对大肠杆菌的抑菌效果最佳,其抑菌圈直径明显大于对照茶多酚,而对金黄色葡萄球杆菌的抑菌效果则相对差一些,但仍优于茶多酚,对枯草芽孢杆菌的抑菌效果则较茶多酚差。当浓度为0.25 mg/mL时,因浓度太低陈皮黄酮和茶多酚均检测不到抑菌活性,由此可初步确定陈皮黄酮的最低抑菌浓度为0.5 mg/mL。

表4 纯化后的陈皮黄酮与茶多酚的抑菌活性比较Table 4 Comparison of antimicrobial activity of purified citrus flavonoids with tea polyphenols

3 结论

本文采用BBD实验模型对陈皮黄酮的提取工艺进行了优化,得到其最佳提取条件为:当提取剂乙醇体积浓度60%,微波功率619 W、微波时间为3 min、温度62 ℃、料液比1∶21 g/mL时,陈皮黄酮得率最高1.3468%±0.0142%,与预测值的偏差仅为0.0107%,说明模型与实际契合度高。

抑菌活性实验表明:纯化后的陈皮黄酮对三种被测菌株均有不同程度的抑菌效果,其中,对大肠杆菌的抑菌效果最佳,对大肠杆菌和金黄色葡萄球杆菌的抑菌效果均优于对照茶多酚,可应用于食品防腐剂、水果保鲜等领域。

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