丹参酮ⅡA磺酸钠对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌纤维化的影响

李泽，孟哲，李宇娜，陶海龙，白中乐，李凌

[郑州大学第一附属医院 心内科（河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室），河南 郑州 450052]

心肌纤维化指在致病因素作用下，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过量沉积，最终导致心脏收缩舒张功能受损的病理性改变[1]。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）能够诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量生成，导致ROS的生成和清除失衡，进而导致心肌纤维化的发生和进展[2-3]。

丹参酮ⅡA是我国传统中药丹参的重要活性成分。丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS）是丹参酮ⅡA经磺化而得到的水溶性药物。研究表明[4-6]，STS具有抗氧化应激、抗纤维化及保护心肌等作用。转录因子NF-E2相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-ralated factor 2，Nrf2）和其胞质接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）参与调控细胞的抗氧化应激反应。本研究旨在观察STS能否减轻Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌纤维化，以及这种抗纤维化的作用是否依赖于Nrf2信号通路，为其应用于临床治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

Ang Ⅱ（美国Sigma-Aldrich公司），Alzet微量渗透泵（美国Durect公司），STS（上海第一生化药业有限公司），细胞核/细胞浆蛋白抽提试剂盒、组织蛋白抽提试剂盒（北京康维世纪生物科技有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），兔抗大鼠Keap1多克隆抗体、小鼠抗大鼠Nrf2单克隆抗体（英国Abcam公司），兔抗大鼠Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）、血红素加氧酶1（HO-1）及醌氧化还原酶1（NQO1）多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗大鼠GCLC多克隆抗体（上海生工生物工程有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）Master Mix、SYBR ® Green real time PCR Master Mix（日本Toyobo公司），总谷胱甘肽（total glutathione，GSH）检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及脂质氧化丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 实验动物

40只SPF级健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，购于河南省实验动物中心。

1.3 方法

1.3.1 心肌纤维化模型复制及处理40只健康SD大鼠随机分成5组，分别为对照组、模型组、低剂量STS组、中剂量STS组、高剂量STS组。采用SNIJDER等[7]所用方法，皮下植入微量渗透泵缓释AngⅡ复制大鼠心肌纤维化模型。适应性喂养3 d，术前禁食12 h，自由饮水。将大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉后，背部肩胛区除毛，消毒后切开皮肤，对照组植入预装0.9%生理盐水的微量渗透泵，模型组与各STS组植入预装Ang Ⅱ[435 ng/（kg·min）]的微量渗透泵，缝合切口。从术后24 h开始，对照组及模型组分别给予0.9%生理盐水[10 ml/（kg·d）]腹腔注射，低、中、高剂量STS组分别给予STS[5、10及20 ml/（kg·d）]腹腔注射，共注射3周。

1.3.2 取材及切片最后一次腹腔注射后24 h，将大鼠处死后立即开胸摘取心脏，0.9%生理盐水灌洗，于室间隔处分离左心室，取部分左心室置于10%甲醛固定（标本用10%甲醛固定后脱水、石蜡包埋并切片）；剩余部分立即置于液氮中冷冻后置于-80℃冰箱冷冻保存，以用于其他指标的检测。

1.3.3 心肌组织病理形态学检查石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精入水，用苏木素-伊红（HE）染色液及马松（Masson）染色液染色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察形态学改变，并对心肌纤维化程度进行Masson染色评分。评分采用Image-Pro Plus 6.0软件计算各组心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。CVF=胶原面积/心肌组织总面积×100%。

1.3.4 Western blot检测取左心室心肌组织，采用细胞核/浆蛋白抽提试剂盒分别提取细胞核、细胞浆蛋白用于Nrf2的检测，采用组织蛋白抽提试剂盒提取总蛋白用于Keap1、Collagen I、Collagen Ⅲ、HO-1、NQO1和GCLC的检测。采用BCA蛋白定量分析试剂盒检测蛋白浓度后，每孔30 μg蛋白上样，6%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流湿转法电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBS-Tween洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h，TBS-Tween洗膜3次，滴加ECL发光试剂，于Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）自动曝光，采集图像后分析条带光密度值。细胞核蛋白采用Lamin B为内参，细胞质蛋白采用β-tubulin为内参，总蛋白采用DAPDH为内参。

1.3.5 qRT-PCR检测使用Trizol提取心肌组织总mRNA，按照说明书的步骤，使用qRT-PCR Master Mix逆转录试剂盒合成cDNA后，在ABI 7500 fast realtime PCR system qRT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司）进行荧光定量扩增。采用2-ΔΔCt方法求得各个目的基因mRNA的相对含量。根据SYBR ® Green realtime PCR Master Mix的使用说明，PCR的反应条件为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40个循环。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.6 心肌MDA、GSH含量及SOD活性的测定取左心室心肌组织，匀浆后取上清液，按照说明书的步骤，采用比色法检测心肌组织中MDA、总GSH含量以及总SOD的活性。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，先进行正态性检验和方差齐性检验，符合条件，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；不符合条件，采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STS减轻Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌纤维化

2.1.1 STS对大鼠心肌病理形态学的改变HE染色结果显示，对照组大鼠心肌组织未见明显炎症细胞浸润，心肌纤维排列均匀致密。模型组大鼠心肌组织可见坏死、心肌纤维断裂、大量炎症细胞浸润。各STS处理组心肌细胞损伤不同程度地减轻，于高剂量STS组改善更为明显（见图1A）。Masson染色结果显示，模型组大鼠心肌纤维化明显，心肌间质可见大量蓝色胶原纤维（见图1B）。各Ang II处理组CVF值差异有统计学意义（F=8.157，P=0.000）。并且随着STS剂量的增加，各STS组CVF值逐渐降低（均P＜0.05）（见表2）。

2.1.2 STS减少大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表达qRT-PCR结果显示，与对照组比较，模型组CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA含量增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图2A）。Western blot结果显示，各Ang Ⅱ处理组胶原蛋白表达量经方差分析，差异有统计学意义（FCollagenI=8.233，P=0.002；FCollagenIII=8.345，P=0.001）。与模型组比较，低剂量STS组Collagen Ⅰ蛋白含量减少，差异有统计学意义（t=2.412，P＜0.05），Collagen Ⅲ蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量 STS组 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白含量降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图2B）。

2.2 STS对Nrf2核转位的影响

qRT-PCR结果显示，各Ang Ⅱ处理组Keap1、Nrf2 mRNA表达量经方差分析，差异有统计学意义（FKeap1=4.001，P=0.027；FNrf2=6.918，P=0.003）。与模型组比较，低剂量STS组Keap1、Nrf2 mRNA含量差异无统计学意义（均P＞0.05），中、高剂量STS组Keap1 mRNA含量减少，Nrf2 mRNA含量增加,差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图3A）。Western blot结果显示，各Ang Ⅱ处理组Keap1、细胞质Nrf2、细胞核Nrf2蛋白表达量经方差分析，差异有统计学意义（FKeap1=9.514，P=0.001；F细胞质Nrf2=7.856，P=0.002；F细胞核Nrf2=7.252，P=0.003）。与模型组比较，中、高剂量STS组Keap1、细胞质Nrf2蛋白含量降低，细胞核Nrf2蛋白含量增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图3B）。

表2 各组 CVF 值比较 （n =8，±s）

表2 各组 CVF 值比较 （n =8，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 CVF值对照组 5.593±3.540模型组 28.796±8.9561）低剂量 STS 组 22.350±5.6792）中剂量 STS 组 19.425±4.3512）高剂量 STS 组 13.975±4.2532）

图1 STS对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化大鼠心肌组织病理形态学的影响

图2 STS对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化大鼠心肌组织中I型、Ⅲ型胶原表达的影响

2.3 STS对大鼠心肌组织中抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶表达的影响

qRT-PCR结果显示，各Ang Ⅱ处理组HO-1、NQO1、GCLC mRNA表达量经方差分析，差异有统计学意义（FHO-1=4.741，P=0.015；FNQO1=4.994，P=0.012；FGCLC=12.289，P=0.000）。与模型组比较，高剂量STS组HO-1、NQO1、GCLC mRNA含量增加,差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图4A）。Western blot结果显示，各Ang Ⅱ处理组HO-1、NQO1、GCLC蛋白表达量经方差分析，差异有统计学意义（FHO-1=11.790，P=0.000 ；FNQO1=7.316，P=0.003 ；FGCLC=41.993，P=0.000）。与模型组比较，中、高剂量STS组HO-1、NQO1、GCLC蛋白含量增高，差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图4B）。

2.4 STS对大鼠心肌组织脂质过氧化水平和抗氧化应激的能力的影响

各Ang Ⅱ处理组MDA、GSH含量及SOD活性经方差分析，差异有统计学意义（FMDA=7.216，P=0.012；FGSH=5.838，P=0.021；FSOD=8.306，P=0.008）。与模型组比较，中、高剂量STS组MDA含量降低,差异有统计学意义（均P＜0.05），GSH含量、SOD活性升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）（见图5）。

图3 STS对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化大鼠心肌组织中Keap1和Nrf2表达的影响

图4 STS对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化大鼠心肌组织中HO-1、NQO1和GCLC表达的影响

图5 STS对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化大鼠心肌组织中MDA、GSH含量及SOD活性

3 讨论

Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）重要的效应因子。Ang Ⅱ通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，促使ROS的生成[3]。过多的ROS引起氧化应激增加，造成心肌肥大、ECM沉积，导致心肌纤维化。ECM中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成增加和比例失调，增加心肌僵硬度，降低心室壁顺应性，引起心室收缩舒张功能障碍，最终导致心力衰竭[8-10]。

丹参是我国传统中药，广泛用于心血管疾病的治疗[11]。丹参酮ⅡA是丹参的主要脂溶性活性成分。研究表明，丹参酮ⅡA能够抑制Ang Ⅱ处理细胞的AT1R受体表达，增强细胞抗氧化应激能力，减少ECM的沉积，减轻心肌纤维化[12-14]。本实验观察到，给予Ang Ⅱ处理后，模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，心肌间质可见大量纤维沉积，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ含量增加，证实Ang Ⅱ可引起心肌纤维化的发生；给予STS处理后，各组大鼠心肌细胞变性坏死程度减轻、心肌纤维化面积减少，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ含量减少，并且这种改善随着STS剂量的增高而更加明显，证明STS能够减轻Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化。

Nrf2属于Cap’-n’-Collar（CNC）家族抗氧化转录因子。研究表明，在生理条件下，Nrf2在胞浆中与其胞质接头蛋白Keap1偶联后被泛素化而降解，其活性处于相对抑制状态。当氧化应激发生时，Nrf2与Keap1解偶联并转移入核，与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合，启动其调控的抗氧化酶（HO-1、GCL及SOD等）和Ⅱ相解毒酶（NQO1、GST等）的表达[15-16]。HO-1降解产物参与细胞的抗氧化应激反应；NQO1、SOD能够保护细胞免受氧自由基及亲电子物质的损伤；谷氨酸半胱氨酸连接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）的催化亚基（GCLC）含有GCL的所有底物结合位点和催化功能，Nrf2可以通过上调GCLC的表达增加GSH的合成，清除ROS，减轻细胞的氧化损伤。MDA是氧自由基与细胞膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的终产物，MDA可衡量氧化应激对细胞造成的损伤程度。实验结果显示，与模型组比较，中、高剂量STS组细胞质Nrf2蛋白含量减少，细胞核Nrf2蛋白含量增加，Nrf2 mRNA含量增加，HO-1、NQO1、GCLC含量增加，说明STS处理可以促进Nrf2核聚集，增强其下游抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的合成；与模型组比较，各STS组大鼠心肌组织中SOD活性增加，MDA含量降低，表明STS能增加大鼠心肌细胞抗氧化应激能力，减轻心肌细胞损伤。本研究发现，中、高剂量的STS可以使大鼠心肌细胞Keap1含量减低，故推测Nrf2核转位增多可能与Keap1含量减少、结合能力的降低，进而导致Nrf2降解减少有关，其具体机制有待进一步的研究。

综上所述，本研究结果表明STS可以呈剂量依赖性地抑制Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化，这种心肌保护作用可能与STS能够促使Nrf2核转位，增加Nrf2调控的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达，从而增强细胞抗氧化应激能力有关。

参 考 文 献：

[1] BERK B C, FUJIWARA K, LEHOUX S. ECM remodeling in hypertensive heart disease[J]. J Clin Invest, 2007, 117(3): 568-575.

[2] DIEZ J. Mechanisms of cardiac fibrosis in hypertension[J]. J Clin Hypertens (Greenwich), 2007, 9(7): 546-550.

[3] GRIENDLING K K, SORESCU D, USHIO-FUKAI M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease[J]. Circ Res,2000, 86(5): 494-501.

[4] ZHU W, LU Q, CHEN H W, et al. Protective effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate on injury of small intestine in rats with sepsis and its mechanism[J]. Chin J Integr Med, 2012, 18(7): 496-501.

[5] YANG L, ZOU X J, GAO X, et al. Sodium tanshinoneⅡA sulfonate attenuates angiotensinⅡ-induced collagen type I expression in cardiac fibroblasts in vitro[J]. Exp Mol Med, 2009,41(7): 508-516.

[6] ZHANG M Q, ZHENG Y L, CHEN H, et al. Sodium tanshinoneⅡA sulfonate protects rat myocardium against ischemiareperfusion injury via activation of PI3K/Akt/FOXO3A/Bim pathway[J]. Acta Pharmacol Sin, 2013, 34(11): 1386-1396.

[7] SNIJDER P M, FRENAY A R, DE BOER R A, et al. Exogenous administration of thiosulfate, a donor of hydrogen sulfide,attenuates angiotensinⅡ-induced hypertensive heart disease in rats[J]. Br J Pharmacol, 2015, 172(6): 1494-1504.

[8] MUNZEL T, GORI T, KEANEY J J, et al. Pathophysiological role of oxidative stress in systolic and diastolic heart failure and its therapeutic implications[J]. Eur Heart J, 2015, 36(38): 2555-2564.

[9] KONG P, CHRISTIA P, FRANGOGIANNIS N G. The pathogenesis of cardiac fibrosis[J]. Cell Mol Life Sci, 2014, 71(4): 549-574.

[10] 谢永进, 盖鲁粤. 血管紧张素Ⅱ致心肌纤维化及其信号转导机制研究进展[J]. 解放军医学院学报, 2014(6): 630-633.

[11] 杨志霞, 林谦, 马利. 丹参对心血管疾病药理作用的文献研究[J].世界中西医结合杂志, 2012, 7(2): 93-96.

[12] YANG R, LIU A, MA X, et al. Sodium tanshinone ⅡA sulfonate protects cardiomyocytes against oxidative stress-mediated apoptosis through inhibiting JNK activation[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2008, 51(4): 396-401.

[13] FU J, HUANG H, LIU J, et al. TanshinoneⅡA protects cardiac myocytes against oxidative stress-triggered damage and apoptosis[J]. Eur J Pharmacol, 2007, 568(1/2/3): 213-221.

[14] MAO S, LI W, QA’ATY N, et al. Tanshinone Ⅱ A inhibits angiotensin Ⅱ induced extracellular matrix remodeling in human cardiac fibroblasts - Implications for treatment of pathologic cardiac remodeling[J]. Int J Cardiol, 2016(202): 110-117.

[15] CULLINAN S B, GORDAN J D, JIN J, et al. The Keap1-BTB protein is an adaptor that bridges Nrf2 to a Cul3-based E3 ligase:oxidative stress sensing by a Cul3-Keap1 ligase[J]. Mol Cell Biol,2004, 24(19): 8477-8486.

[16] LAU A, VILLENEUVE N F, SUN Z, et al. Dual roles of Nrf2 in cancer[J]. Pharmacol Res, 2008, 58(5/6): 262-270.