乳腺癌患者血清中miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246的表达及临床意义*

舒耀，吴斌，宋俊

（西南医科大学附属医院 乳腺外科，四川 泸州 646000）

乳腺癌（breast cancer，BC）是全球妇女中最常见的癌症，BC的早期诊断对于提高患者的生存率及生活质量至关重要。乳腺钼靶和超声成像被广泛用于BC的筛查，但乳腺摄影术中乳房密度增加会降低检查的敏感性，钼靶的阳性检出率并不高[1]。两种基于血清的肿瘤生物标志物（CA15-3和CEA）用于检测BC，但敏感性和特异性有限[2]。因此新型和更准确的无创生物诊断标志物引起人们的关注。到目前为止，研究已经证明微小RNA（miRNA）不仅在肿瘤组织中异常表达，也会在外周血中稳定存在，其可作为肿瘤诊断的生物标志物[3]。本研究对48例BC患者进行血清miRNA-210、miRNA-21和miRNA-1246水平检测，分析其与BC发病的关系及诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月-2017年6月西南医科大学附属医院乳腺外科确诊的女性BC患者48例（BC组）。年龄34～69岁，中位52岁；绝经前患者20例（41.7%），绝经后28例（58.3%）；非浸润性癌6例（12.5%），浸润性癌42例（87.5%）；肿瘤直径小于2 cm者15例（31.3%），直径2～5 cm者33例（68.7%）；有淋巴结转移者13例（27.1%），无淋巴结转移者35例（72.9%）；TNM分期（UICC第7版）：0期15例（31.3%），Ⅰ期9例（18.8%），Ⅱ期14例（29.2%），Ⅲ期10例（20.8%）。入选标准：①所有病例均经病理学诊断确诊为BC；②具备完整的临床资料；③取得标本前均未接受过新辅助治疗；④既往无肿瘤病史且无其他部位转移的BC患者。

正常对照组为同一时期进行年度体检的健康女性48例（对照组）。年龄37～68岁，中位53岁。两组患者在年龄、体重指数、哺乳史及月经史等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过医院伦理委员会审批，所有患者均知晓本研究目的、过程和意义，并同意参与，签署知情同意书。

1.2 材料与试剂

1.2.1 标本采集BC患者于手术前1天抽取清晨空腹静脉血6 ml、对照组受试者体检的当日（空腹10 h以上）采集其肘静脉血6 ml（含促凝胶的真空采血管），室温静置30 min～1 h，血液凝固后取上清于洁净1.5 ml EP管，置入-80℃冰箱保存待测。

1.2.2 试剂血清miRNA提取试剂（10% PEG试剂、lysis buffer），探针及引物设计（美国Applied Biosyste公司），Rever Tra Ace qRT-PCR Kit，THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（东洋坊上海科技生物有限公司）。

1.2.3 仪器与设备ABI-7500荧光定量PCR仪（ABI公司、美国），离心机（Eppendorf、德国），37℃水浴锅、95℃金属浴锅（北京田园奥瑞生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取将血清样本置入离心机中4℃5 000 r/min离心30 min，取400 μl上层血清于洁净1.5 ml EP管中，加入44 μl 10% PEG试剂，于4℃冰箱静置沉淀2 h，再于离心机4℃ 5 000 r/min离心10 min，得到的沉淀用400 μl柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L、pH=4.5）冲洗3次，再次于离心机中4℃ 5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，往剩余的沉淀中加入20 μl lysis buffer溶液。

1.3.2 cDNA合成严格按照Rever Tra ACE qRTPCR试剂盒说明书进行逆转录反应。反应体系：RNA模板 5 μl，引物 miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246、U6 各 1 μl，Enzyme Mix 1 μl、5×Buffer 4 μl、DEPC水6 μl。逆转录条件：37℃水浴箱中2 h，待转录结束后再置于95℃金属浴中5 min，然后立即置于冰盒上。

1.3.3 实时荧光定量PCR（quantitative real-timepolymerase chain reaction，qRT-PCR）检测以荧光定量PCR仪使用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix试剂盒进行扩增反应，以U6为内参检测目的基因相对表达水平，U6、miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246引物序列见表1。反应体系：cDNA产物2 μl，2×miRNA qPCR Mix 10 μl，20× 引物各 1 μl，余用MQ水补齐至20 μl。扩增条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸60 s，共40个循环，所有反应设立2个复孔。根据各样品qRT-PCR曲线得到Ct值，Ct值表示荧光达到阈值所需要的循环数。miR-21/210/1246在乳腺癌患者血清中的相对表达量用2-△△Ct描述，△△ Ct=（CtmiR-21/210/1246-CtU6）乳腺癌-（CtmiR-21/210/1246-CtU6）对照组。

表1 引物序列

1.4 评判标准

ROC曲线下面积值1.0～0.5。在AUC＞0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。0.5＜AUC＜0.7时有较低准确性；0.7≤AUC≤0.9时有一定准确性，AUC＞0.9以上时有较高准确性。AUC=0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。约登指数（youden index，YI）表示诊断试验（或某一种检测方法）发现真正的患者与非患者的总能力；约登指数=敏感性+特异性-1，其值于0～1之间波动，其值愈大，说明该诊断试验（检测方法）的真实性越好且更稳定，其诊断价值越高。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0和MedCalc统计软件，定性资料用频数及百分率表示，定量资料用中位数及其四分位数间距表示，采用秩和检验，利用ROC曲线确定不同指标对BC的诊断价值，P＜0.05为差异有统计学意义。BC的最佳诊断模型由Fisher判别分析建立。

2 结果

2.1 两组miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246的表达水平

BC组患者血清miRNA-21的相对表达水平为0.591（0.340，1.022），对照组相对表达水平为0.145（0.078，0.193）（Z=-7.108，P =0.001）。BC组患者血清miRNA-210的相对表达水平为1.187（0.411，2.043），对照组相对表达水平为0.060（0.032，0.100）（Z=-8.112，P =0.000）。BC组患者血清miRNA-1246的相对表达水平为109.758（33.201，282.513），对照组相对表达水平为36.383（18.777，65.918）（Z=-4.008，P =0.000）。miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246 3 者在BC组患者血清中的表达水平均升高。

2.2 血清 miRNA-210、miRNA1246、miRNA-21水平与BC患者临床特征的关系

血清miRNA-210、miRNA-1246、miRNA-21在Ⅲ期BC患者或有淋巴结转移的患者中高表达（P＜0.05），而与绝经状况、肿瘤大小及病理类型无关系（P＞0.05）。见表2。

2.3 血清miRNA在BC诊断中的ROC曲线分析

通过ROC曲线分析显示，miRNA-210曲线下面 积（AUC） 为 0.980（95%CI：0.928，0.998）， 敏感性为 95.80%（95%CI：0.857，0.995），特异性为91.70%（95%CI：0.800，0.977），约登指数为0.875；miRNA-21的 AUC 为 0.936（95%CI：0.866，0.976），敏感性为89.60%（95%CI：0.773，0.965），特异性为85.40%（95%CI：0.722，0.939），约登指数为0.750；miRNA-1246 的 AUC 为 0.737（95%CI：0.638，0.822），敏感性为 58.30%（95%CI：0.432，0.724），特异性为89.60%（95%CI：0.773，0.965），约登指数为0.479。提 示 miRNA-210、miRNA-21、miRNA-1246对 BC均有一定诊断效能。而AUC miRNA-21+miRNA-210+miRNA-1246=AUC miRNA-210+miRNA-1246＞AUC miRNA-21+miRNA-210＞AUC miRNA-21+miRNA-1246。AUC miRNA-210+miRNA-1246 vs AUC miRNA-210，差异无统计学意义（Z=1.332，P=0.183），也就是说miRNA-210+miRNA-1246联合检测、miRNA-21+miRNA-210+miRNA-1246联合检测的诊断效能并不优于miRNA-210单独检测。见表3和图1。

表2 BC患者血清miRNA-210、miRNA-1246、miRNA-21表达水平与临床特征的关系

续表2

2.4 BC诊断模型的建立

Fisher判别分析用于建立BC的最佳诊断模型，其中进入F=3.84，移除F=2.71，得到：miRNA-21（a1）、miRNA-210（a2）、miRNA-1246（a3）的判别方程系数，见表4和图2。

表3 不同指标或指标组合的诊断价值比较 （n =48）

即，当将患者上述参数（a1～a3）分别带入方程Q1、Q2，当Q1＞Q2时，认为该患者应归为对照组（正常组）；当Q1＜Q2时，认为该患者应归为病例组，应对该患者做进一步的筛查与核实。

应用该模型对本样本进行回代判别，结果显示：本判别模型的敏感性为62.5%；特异性为100.0%，即该模型排除非患者的能力较好，而发现患者的能力相对较弱，见表5。

图1 不同指标的诊断价值比较

表4 分类函数系数 （未标准化）

图2 判别分析对BC诊断的效果图

表5 判别模型的分类结果

3 讨论

miRNA是21～25个核苷酸组成的非编码RNA，其在转录后水平上以序列特异性方式负调节基因表达。每个miRNA通过与靶mRNA的3'-非翻译区结合以诱导信号降解或抑制翻译来控制多个靶基因的表达。miRNA表达可以对细胞表型和功能产生重要的影响[4]。许多研究发现，miRNA与肿瘤的发展，侵袭，转移和其他特征密切相关，表明miRNA有可能成为癌症治疗新策略的基础[5]。CHEN等[6-7]将各种来源的血清miRNA在恶劣条件下进行处理，发现煮沸、低/高pH，RNA降解酶、反复冻融或延长储存时间等方法均不会造成miRNA的损失，进一步证实血清miRNA的稳定性，其具备作为疾病分子生物标志物的许多优点。几项研究已经评估血清或血浆miRNA作为不同类型癌症的生物标志物的潜在用途，如肺癌、结直肠癌、卵巢癌、肾细胞癌、舌鳞状细胞癌及成胶质细胞瘤[8-13]。

miRNA-21在大多数人类肿瘤中表达，已被证明是致癌过程中的关键调节因子，在肿瘤形成和进展中起重要作用。IORIO等[14]报道miRNA-21在BC组织中过表达，可能是BC有用标记。WANG等[15]使用qRTPCR测定结直肠癌组织或细胞系中miRNA-1246的miRNA表达水平，发现miRNA-1246在肿瘤组织中的表达水平高于成对的相邻组织。此外，SW620、SW480、HCT116、HT29和LOVO细胞系中miRNA-1246的表达水平也比正常肠上皮细胞高，结果提示miRNA-1246可能参与结直肠癌的形成和进展，其可能具有促癌基因的作用。位于染色体11p15.5上的miRNA-210在许多人类癌症中过表达[16-18]。miRNA-210过度表达，特别是在缺氧条件下，影响涉及肿瘤发展的许多过程，包括促进血管生成和DNA修复能力的降低[17，19]。尿路上皮细胞癌（UTUC）组织中miRNA-210表达高于非癌性尿路上皮细胞，且miRNA-210表达水平与肿瘤分期和组织学分级正相关，这提示miRNA-210可能是UTUC的重要致癌因子[20]。本研究均证明，恶性肿瘤的发生、进展与miRNA表达失衡有关。但是通过活检或手术取得标本是1个有创过程，容易引起邻近组织损伤或癌症转移。

YING等[21]研究证实miRNA-210过表达促进癌细胞的侵袭和转移。ROTKRUA等[22]发现，miRNA-210的血清水平在弥漫性胃癌的小鼠模型中高于对照组。YU等[23]提出miRNA-210可能是早期检测胃癌的可靠标志物。HENEGHAN等[24]发现在148例BC患者的循环血中，miRNA-195和let-7a的水平较正常对照组高，肿瘤切除后降低至与对照组相当的水平。上述研究表明，血清miRNA的检测可以作为癌症无创诊断的潜在生物标志物。本研究结果显示，BC组患者的水平高于对照组（P＜0.001），提示3者在BC患者中可能发挥促癌基因的作用，其血清水平过表达可能是BC诊断的潜在生物标志物。进一步分析发现，BC患者miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246血清水平与临床特征相关，3者在BCⅢ期患者、有淋巴结转移的患者高表达（P＜0.05）。以上结果表明，miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246不但参与BC发病，还可能与肿瘤细胞转移、临床分期有关。WANG等[25]发现miRNA-21在BC患者血清中增高（P＜0.001）。CHEN等[26]提出BC患者血清miRNA-21高表达不仅与BC的发生有关，而且与淋巴结转移有关。YAN等[27]研究表明，miRNA-21的过表达与临床分期、淋巴结转移和预后差相关。上述3个研究结论与本文结果一致。

为进一步评估血清miRNA-21、miRNA-210、miRNA-1246对BC诊断的价值，本研究分别对3者做ROC曲线分析，结果显示，miRNA-210+miRNA-1246联合检测、miRNA-21+miRNA-210+miRNA-1246联合检测的诊断效果并不优于miRNA-210单独检测。Fisher判别分析用于建立BC的最佳诊断模型，该模型的敏感性为62.5%；特异性为100.0%，即排除非患者的能力较好，而发现患者的能力相对较弱。故miRNA-210可能是一种理想的BC诊断标志物。

综上所述，BC患者血清miRNA-21、miRNA-210和miRNA-1246水平呈高表达状态，对BC有一定的诊断价值，miRNA-210对BC的诊断价值可能最高。3者与肿瘤分期和淋巴结转移有关系。本研究存在样本量小，仅对比BC患者和健康组血清miRNA的表达水平，未深入研究多种因素如手术、化疗等对血清中miRNA的影响。将在后续的研究中开展相应的工作。

参 考 文 献：

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