Fe3O4纳米颗粒的制备及成像分析

邓寒霜，李筱玲，高明明

（1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2.西安凯立新材料股份有限公司，陕西 西安 710201）

磁性纳米材料在磁流体、 磁性荧光纳米颗粒成像、磁热疗、磁靶向药物载体、细胞标记、蛋白质纯化等领域应用广泛［1］。目前，对以铁磁性纳米材料（如Fe3O4，γ-Fe2O3）为代表的磁性纳米材料的研究已经取得了较大进展。Fe3O4纳米颗粒具有独特的表面效应和量子尺寸效应，在热、电、光、磁等方面应用广泛［2］。Fe3O4纳米颗粒在交变磁场下能够产热，可通过磁热疗的方式将肿瘤细胞杀死［3］；Fe3O4纳米颗粒在人体内血液循环时间较长，能够与药物分子以共价键或静电吸附的形式相结合，可作为理想的药物载体［4］；Fe3O4纳米颗粒能够快速、高效进行细胞分离［5］和蛋白质纯化等［6］；Fe3O4磁性纳米颗粒具有较高的空间分辨率，可在核磁共振成像中用于T1（正增强显影）和T2（负增强显影）造影剂［7-8］。

活体磁共振（MR）成像技术由于具有分辨率高的特点已在临床得到广泛应用［9］。目前，临床MR成像中使用的造影剂主要分为顺磁性、铁磁性和超顺磁性［10-12］。Fe3O4纳米颗粒的尺寸范围从几个纳米到几十个纳米，受到表面效应的影响极易发生团聚现象，采用适当的方法得到在水相中稳定、弛豫性能高、毒性小、均匀分散的纳米颗粒是研究者需要解决的难题。

本工作选用高温溶剂热分解法制备油相Fe3O4纳米颗粒［13］。通过控制Fe3O4纳米颗粒的粒径大小、形貌、表面功能化修饰，提高纳米颗粒的弛豫性能、稳定性及生物相容性，并赋予Fe3O4纳米颗粒荧光特性，为Fe3O4纳米颗粒在MR成像中的应用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 主要试剂

油酸（AR）、无水乙醇（AR）、1，2-十六烷二醇（纯度97%（w））、苯基醚（纯度大于99%（w））：阿拉丁试剂公司；油酸铁、氯仿、二甲基亚砜（DMSO）：AR，天津市致远化学试剂有限公司；聚乙烯亚胺（PEI）：纯度99%（w），广东翁江化学试剂有限公司；异硫氰酸酯（FITC）：纯度大于95%（w），上海金穗生物科技有限公司。

1.2 纳米颗粒的制备

4 nm油相Fe3O4纳米颗粒的制备：将一定量油酸铁和1，2-十六烷二醇加入到油酸、苯基醚、油胺的混合溶剂中。充N2、磁力搅拌条件下，将混合体系升温至120 ℃，陈化排除体系水后，在冷凝回流条件下升温至250 ℃并恒温反应一段时间，反应结束后冷却产物至室温。向混合物中加入无水乙醇，离心洗涤，收集黑色沉淀产物，正己烷重新分散后加入无水乙醇，重复离心洗涤三次，干燥得黑色油相Fe3O4纳米颗粒。

Fe3O4-PEI纳米颗粒的制备：取干燥黑色油相Fe3O4纳米颗粒及PEI溶解于一定量氯仿中，超声一定时间后置于圆周型恒温摇床上40 ℃下反应。反应完后在30 ℃下干燥使溶剂完全挥发。将干燥后的Fe3O4纳米颗粒加入去离子水中超声，离心得水相Fe3O4-PEI纳米颗粒。

磁性荧光Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的制备：取一定量水相Fe3O4-PEI纳米颗粒溶于去离子水中，用0.5 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至9.0。用DMSO溶解FITC，并加入到水相Fe3O4-PEI纳米颗粒水溶液中，混合均匀，置于摇床上（300 r/min）振荡反应。待反应结束后，离心洗涤，弃上层清液，加入无水乙醇重新溶解后再重复离心洗涤，直至上层清液在490 nm处无紫外吸收峰。

1.3 表征方法

采用美国FEI公司Tecnai G2F20S-TWIN型透射电子显微镜观察纳米颗粒形貌，加速电压200 kV；采用日本Rigaku公司D/max 2200PC型X射线衍射分析仪对纳米颗粒晶体类型进行分析，Cu Kα射线，扫描范围10°～80°；采用德国Bruker光谱仪器公司Tensor 27型红外光谱仪测定吸收峰，溴化钾压片，扫描范围500～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1；室温下将磁性纳米颗粒置于思普特公司SPT-VSM-130型振动磁强计上测定试样的磁滞回线，最大磁场强度6×103A/m；采用德国耐驰公司STA409C型热分析仪作热重分析，载气N2，升温速率10 ℃/min，最高温度800 ℃；采用英国马尔文公司Mastersizer 3000型马尔文动态光散射激光粒度仪测定不同pH下试样的Zeta电位，纳米颗粒溶液pH用NaOH和HCl溶液调节，pH范围为2～13。

2 结果与讨论

2.1 油相Fe3O4纳米颗粒表征结果

2.1.1 形貌及结构表征结果

图1为4 nm油相Fe3O4纳米颗粒TEM照片及粒径分布。由图1可知，油相Fe3O4纳米颗粒呈球形，具有单分散性。图2为4 nm油相Fe3O4纳米颗粒XRD谱图。由图2可知，制备的Fe3O4纳米颗粒具有立方尖晶石结构。

2.1.2 VSM表征结果

图3为油相Fe3O4纳米颗粒的磁滞回线。由图3可知，纳米颗粒在300 kHz时没有剩余磁场和矫顽力，说明纳米颗粒具有超顺磁特性。饱和磁化强度为53×103A/（m·g），明显低于油相Fe3O4体相的饱和磁化强度，可能是油相Fe3O4纳米颗粒表面覆盖了一层油酸的缘故［14］。

图1 4 nm油相Fe3O4纳米颗粒TEM照片及粒径分布Fig.1 TEM photograph and size distribution of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

图2 4 nm油相Fe3O4纳米颗粒的XRD谱图Fig.2 XRD spectrum of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

图3 4 nm油相Fe3O4纳米颗粒的磁滞回线Fig.3 Hysteresis curve of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

2.1.3 FTIR表征结果

图4为油相Fe3O4纳米颗粒FTIR谱图。由图4可知，在2 929 cm-1和2 856 cm-1处为亚甲基—CH2—的不对称和对称振动吸收峰；在1 426 cm-1处为C==O键的对称伸缩振动峰，表明油酸分子中的羧基在Fe3O4纳米颗粒表面与Fe原子结合形成了共价键。

2.1.4 TG表征结果

图5为4 nm油相Fe3O4纳米颗粒的TG曲线。由图5可知，曲线出现两个失重阶段，第一个阶段在100～300 ℃，主要是Fe3O4纳米颗粒孔隙吸附水和结构水的脱除；第二个阶段在300～600 ℃，在此阶段纳米颗粒失重率有明显下降，这是由于纳米颗粒表面的油酸逐渐脱除，加热到600 ℃时，失重率达到38%。温度高于600 ℃时，质量维持恒定，说明表面油酸脱除完全。

图4 4 nm油相Fe3O4纳米颗粒的FTIR谱图Fig.4 FTIR spectrum of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

图5 4 nm油相Fe3O4纳米颗粒的TG曲线Fig.5 TG curve of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

2.2 表面修饰Fe3O4纳米颗粒的表征结果

2.2.1 粒径分布

图6为4 nm油相Fe3O4纳米颗粒经表面修饰后的粒径分布。由图6可知，经PEI包覆油相纳米颗粒后对应的水合直径为10.9 nm，Fe3O4-PEI纳米颗粒经FITC修饰后水合直径变为18.8 nm，粒径随着水相纳米颗粒尺寸增大而增大，且尺寸分布较窄，说明经一系列表面修饰后纳米颗粒没有出现团聚现象，在水相中均匀分散。

图6 纳米颗粒经表面修饰后的粒径分布Fig.6 Size distribution of surface modified nanoparticles.PEI：polyethyleneimine；FITC：fluorescein isothiocyanate.

2.2.2 Zeta电位

由于静电斥力作用，Fe3O4纳米颗粒在水溶液中Zeta电位（绝对值）越大，溶液越趋于稳定状态，纳米颗粒在溶液中分散越均匀。PEI分子中含有大量的氨基，经PEI包覆油相纳米颗粒后，溶液中形成NH3+，使得纳米颗粒表面带正电荷，水相纳米颗粒对应的等电点为10.3。图7为4 nm油相Fe3O4纳米颗粒经表面修饰后的Zeta电位。

图7 纳米颗粒经表面修饰后的Zeta电位Fig.7 Zeta-potentials of surface modified nanoparticles.

由图7可知，在pH=7时，PEI对应的Zeta电位为24.6 mV，表明Fe3O4-PEI纳米颗粒水溶液在中性条件下较稳定。FITC修饰水相Fe3O4-PEI纳米颗粒，对应的等电点为8.9，等电点相对降低，说明PEI分子表面氨基与FITC反应，纳米颗粒表面所带正电荷减少。在pH=7时，对应的Zeta电位为15.7 mV，表明经FITC修饰后的水相Fe3O4-PEI纳米颗粒在中性条件下也较稳定。

2.2.3 FTIR表征结果

图8为Fe3O4-PEI和Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的FTIR谱图。由图8可知，Fe3O4-PEI谱线在1 638 cm-1处的特征吸收峰归属于C—N键的伸缩振动，在3 385 cm-1处的特征吸收峰归属于N—H键的伸缩振动，在1 157 cm-1和1 108 cm-1处的特征吸收峰分别归属于 NH2和NH的不对称振动吸收，说明存在伯氨基，即PEI分子成功包覆在Fe3O4纳米颗粒表面；Fe3O4-PEI-FITC曲线在1 630 cm-1处出现了酰胺键的特征吸收峰，说明PEI分子上的伯氨基和FITC发生反应，FITC荧光分子成功接枝于纳米颗粒表面。

图8 纳米颗粒经表面修饰后的FTIR谱图Fig.8 FTIR spectra of surface modified nanoparticles.

2.2.4 Fe3O4-PEI-FITC 纳米颗粒荧光稳定性分析

图9为Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒水溶液的荧光强度。

图9 Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的荧光稳定性Fig.9 Fluorescent stability of Fe3O4-PEI-FITC nanoparticles.The hydrodynamic diameter of the nanoparticles is 18.8 nm.

由图9可知，经表面荧光修饰后的Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒没有明显的荧光猝灭现象发生，稳定性较好。表明Fe3O4纳米颗粒经PEI包覆后，阻止了荧光分子与Fe3O4纳米颗粒内核相结合，极大程度降低了Fe3O4纳米颗粒内核带来的荧光猝灭现象发生。

2.2.5 Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒VSM表征结果

图10为Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的磁滞回线。由图10可知，Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的饱和磁化强度为42×103A/（m·g），小于油相纳米颗粒的饱和磁化强度53×103A/（m·g）。但纳米颗粒在300 kHz时没有剩磁和矫顽力，纳米颗粒仍具有超顺磁特性。

图10 Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的磁滞回线Fig.10 Hysteresis curve of Fe3O4-PEI-FITC nanoparticles.The hydrodynamic diameter of the nanoparticles is 18.8 nm.

2.3 磁性荧光Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒MR成像研究

2.3.1 细胞毒性分析

采用四唑盐比色法来探究经PEI和FITC修饰后Fe3O4纳米颗粒的细胞相容性。对于Fe3O4纳米颗粒，随着Fe离子含量的升高，细胞存活率逐渐降低，但经修饰后的Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的细胞存活率仍在83%以上，即使当Fe离子含量达180 μg/mL，细胞增值仍受较小影响。表明经PEI和FITC修饰后的Fe3O4纳米颗粒细胞相容性较好。

2.3.2 弛豫率及MR成像分析

Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒的内核尺寸大小影响纵向弛豫时间（t1）及横向弛豫时间（t2），从而使MR信号强弱受到影响。纵向弛豫率（r1）及横向弛豫率（r2）可分别通过不同Fe含量的Fe3O4纳米颗粒的t1，t2的倒数拟合得到［15］，r1和r2的大小直接反应出纳米颗粒作为T1和T2造影剂的潜力。

图11为Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒Fe含量与1/t1、1/t2的线性关系。由图11可知，Fe3O4-PEIFITC纳米颗粒的1/t1，1/t2与Fe含量均呈现出良好的线性关系。通过计算可得水动力学直径为18.8 nm的Fe3O4纳米颗粒的r1= 7.96 m/ms，r2= 25.83 m/ms。结合Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒对应的T1，T2加权MR成像图分析，Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒（内核尺寸为4 nm）的T1加权MR成像图有较为明显的逐渐变亮趋势，MR成像信号增强，但T2加权MR成像图变暗趋势不明显。因此，表面修饰后的水动力学直径为18.8 nm的Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒更适合作为T1造影剂。

图11 Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒Fe含量与1/t1、1/t2的线性关系Fig.11 Linear relationship of the Fe3O4-PEI-FITC nanoparticles Fe content to 1/t1 and 1/t2 .t1：longitudinal relaxation time；t2：transverse relaxation time；r1：longitudinal relaxation rate；r2：transverse relaxation rate.The hydrodynamic diameter of the nanoparticles is 18.8 nm.

3 结论

1）制备的4 nm油相Fe3O4纳米颗粒表面成功包覆了油酸分子，纳米颗粒单分散性较好，颗粒大小均匀且呈球形，具有立方尖晶石结构。在室温下无剩磁和矫顽力且具有超顺磁特性。

2）经PEI及FITC功能化修饰后的Fe3O4纳米颗粒，水动力学直径增大，颗粒尺寸分布较窄；在中性条件下，可在水相中均匀、稳定存在，饱和磁化强度降低，但仍具有超顺磁特性，荧光稳定性较好，没有明显的荧光猝灭现象。

3）磁性荧光Fe3O4-PEI-FITC纳米颗粒具有良好的细胞相容性；拟合计算可得纳米颗粒的r1=7.96 m/ms，r2= 25.83 m/ms；结合MR加权成像图分析，该纳米颗粒适合应用于T1造影剂。

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