大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离与鉴定

王 效,肖 良,徐宏光,金中行

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 脊柱外科，安徽 芜湖 241001)

椎间盘由上下边界椎体终板、中间由外到内依次是纤维环和髓核组成，其退变是由负荷、年龄、外伤等多种因素介导的慢性过程，可以引起椎间隙狭窄、运动阶段失稳、小关节退变，进而引起神经卡压和刺激，进一步导致临床上的腰腿痛和下腰痛症状。临床上内科治疗多以理疗为主，外科手术虽然能解决终末期症状，但是无法改变脊柱在压力负荷下的退变进程。本文利用干细胞自身生长特点，采用单克隆法培养出细胞集落，通过成骨、成脂肪及成软骨的三向诱导，证明了该集落具有干细胞性质，为椎间盘退变的治疗提供了新思路。运用干细胞治疗椎间盘退变不仅能维持脊柱正常的受力形态，而且能大幅度减少手术造成的创伤，具有巨大的潜力和社会经济效益。

1 材料与方法

1.1 主要材料 0.05%透明质酸酶，0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%二型胶原酶(Sigma),DMEM/F12(Gebico),干细胞血清(双洳)，地塞米松，胰岛素，吲哚美辛，β-磷酸甘油,L-抗坏血酸-2-磷酸酯,甲基异丁基黄嘌呤(IBMX),脯氨酸,丙酮酸钠,胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸混合物,肿瘤生长因子-b3。油红O染色剂，茜素红染色剂，甲苯胺蓝染色剂，10 cm培养皿。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腰椎终板软骨原代细胞的获取 取4周龄大鼠幼鼠1只，给予颈椎脱臼法处死后，全部浸没于75%的酒精10 min，无菌条件下分离大鼠幼鼠腰椎L1～L5，解剖显微镜下分离终板软骨(图1)，然后将分离到的软骨浸泡在含有双抗的PBS中10 min，取出后PBS冲洗3次，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。先加入0.05%的透明质酸酶，室温下作用20 min。1000 r/min离心5 min后弃上清，加入0.25%EDTA-胰酶，置于37℃温水浴箱中40 min后再次离心并弃上清，最后加入0.2%二型胶原酶，重新置于水浴箱中消化5 h左右，每30 min震荡一次以加速消化。待组织完全消化后用200目滤网过滤，1500 r/min离心5 min，弃上清，重新加入培养基吹打混匀，备用。

图1 新生4周龄大鼠幼鼠的脊柱标本

1.2.2 单克隆法获取腰椎终板软骨干细胞(stem cells derived from the lumbar endplate cartilage，EPCSCs) 单克隆法已经证实可以获得间充质干细胞[1]及人纤维环干细胞[2]。是否能成功运用此法提取EPCSCs尚未知，故我们按照50、100、200、300个/cm2把细胞接种到10 cm培养皿中并培养10 d，PBS冲洗1遍后用4%的多聚甲醛固定30 min，继续用PBS冲洗2遍后用0.1%的结晶紫染色，并计算细胞集簇形成数目。

1.2.3 成骨方向诱导分化 将用单克隆法得到的细胞，用0.25%EDTA-胰酶消化后，按照2×104个/孔的密度接种于24孔板中，待24 h细胞贴壁后，将一般培养基更换为诱导成骨分化的培养基(包含10% FBS、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸酯)。每3 d换一次液，连续诱导2～3周后用茜素红染色。

1.2.4 成软骨方向诱导分化 按照Micromass法[3]进行成软骨方向分化，按照2×104个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞融合达80%时，加入诱导软骨分化培养基(包含10% FBS、1%ITS、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸酯和10 μg/L重组人 TGFβ1)，每3 d换液1次，持续诱导3周后用甲苯胺蓝染色。

1.2.5 成脂肪方向诱导分化 按照2×104个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞融合达80%～90%时，加入诱导脂肪分化培养基(包含10% FBS、500 μmol/L甲基异丁基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松、60 μmol/L吲哚美辛和 5 mg /L胰岛素)，诱导3 d，然后更换为维持脂肪分化培养基(包含 10% FBS、10 mg/L胰岛素)，诱导1 d，然后再更换为诱导脂肪分化培养基诱导3 d，如此循环3个周期后用油红O染色，苏木素复染后镜下观察。在此需注意的是将原代融合80%～90%时更利于脂肪诱导分化，2种不同类型的培养基更换时不要使细胞处于无培养基状态。

1.2.6 单克隆形成能力检测 单克隆形成能力是干细胞的一个重要特性，为了验证经过单克隆法获取的细胞集落是否具有这一性质，将原代获得的细胞集落用酶消化法消化后，按照100、200、300个/cm2细胞接种于10 cm的培养皿中，一式三份，加入培养基培养10～12 d，然后用0.1%结晶紫染色，计数肉眼能观察到的细胞集簇。

2 结果

2.1 单克隆法提取EPCSCs 结果显示：当大鼠腰椎终板软骨细胞接种在10 cm培养皿后，大部分细胞在2～3 d之内仍保持原来形态，可见极少数细胞贴壁。在单克隆3 d后，可见培养皿中有细胞集簇形成，5 d后，集簇明显，且大体形态呈梭形，细胞排列有序。培养10 d后细胞接近融合，此时进行传代培养。结晶紫染色可见细胞集簇，按照大于20个/簇的标准计数，发现以200个/cm2的密度接种时，细胞集簇形成最多(图2)。

A.原代细胞经单克隆法培养后形成的细胞集落;B.3 d后观察集落形成(400×);C.5 d后可见明显细胞集落。

图2 单克隆法提取EPCSCs

2.2 腰椎终板软骨细胞与干细胞的形态比较 在倒置相差显微镜下，刚接种的软骨细胞呈圆形，培养24 h后贴壁，呈圆形或椭圆形，继续培养后呈不规则四角形或者三角形，类似铺路石样。而经过单克隆培养获得的细胞，细胞整体形态较软骨细胞小，多呈椭圆形或梭形，且细胞排列方向一致(图3)。

2.3 成骨诱导分化 经过2～3周的成骨诱导后，实验组和对照组经过茜素红染色，显微镜下观察发现，经过单克隆培养获得的细胞可以形成钙结节而被染成红色，对照组无钙结节而不着色(图4)。

A.软骨细胞正常培养甲苯胺蓝染色(400×);B.细胞集落高倍镜下形态(400×)。

图3 成骨诱导分化

图4 成骨诱导后实验组与对照组经茜素红染色后对比(400×)

2.4 成脂肪诱导分化 经过21 d的成脂肪诱导，显微镜下可以观察到细胞上方出现较明显的脂肪滴，经油红O染色后，可见脂肪滴被染成红色，分布在细胞内。对照组无染色(图5)。

成脂肪诱导后可见脂肪滴形成，油红O染色及苏木素复染后镜下对比(400×)。

图5 成脂肪诱导分化

2.5 成软骨诱导分化 经过21 d成软骨诱导后，实验组被染成深红色，说明有软骨形成，而对照组被染成浅红色(图6)。

成软骨诱导后，实验组被染成深红色，对照组被染成浅红色(400×)。

图6 成软骨诱导分化

2.6 单克隆形成能力检测 将获得的细胞集簇接种于10 cm培养皿，培养12 d，肉眼可见细胞集落形成(图7)。

图7 获得的细胞集簇进行单克隆形成能力检测

3 讨论

腰椎软骨干细胞属于成体干细胞的一种，目前获得成体干细胞的方法主要有：①定向诱导胚胎干细胞分化为成体干细胞，但是诱导条件复杂，现已很少采用。②根据干细胞的生长特性，体外分离培养动物的某些部位来获取特定的细胞。此法采用较多。目前已知干细胞具有单克隆形成能力、成骨、成脂肪及成软骨分化的重要特性[4]。本文先利用单克隆法，将原代接种于培养皿中获得细胞集落，后用三向分化能力[5]、集落的单克隆形成能力检测，验证通过此法获得细胞具有干细胞特性。当然，本文的不足之处就是未通过免疫学方法验证该干细胞。但是通过部位取材、原代染色、单克隆能力检测、三向分化诱导这些严密环节，也能证明出所获取的为腰椎终板软骨干细胞。

干细胞的研究为疾病的临床治疗提供了新思路，早在1743 年hunter[6]就认为软骨损伤不能修复，上个世纪Namba 和Meuli[7]提出软骨的修复只发生在胚胎动物。目前成体动物缺损修复的难点在于难以获取大量的前提增殖细胞。本文提供的单克隆法大大节约了获取的经济成本，简化了获取流程，为今后进一步研究干细胞及其临床应用奠定了基础。

【参考文献】

[1] LIU S,LIANG H,LEE SM,etal.Isolation and identification of stem cells from degenerated human intervertebral discs and their migration characteristics[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)，2017，49(2)：101-109.

[2] LIU C,GUO Q,LI J,etal.Identification of rabbit annulus fibrosus-derived stem cells[J].PLoS One，2014，9(9):e108239.

[3] MELLO MA,TUAN RS.High density micromass cultures of embryonic limb bud mesenchymal cells:an in vitro model of endochondral skeletal development[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，1999，35(5):262-269.

[4] DOMINIC M,LE BK,MUELLER I,etal.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy，2006，8(4):315-317.

[5] LIU LT,HUANG B,LI CQ,etal.Characteristics of stem cells derived from the degenerated human intervertebral disc cartilage endplate[J].PLoS One，2011，6(10):e26285.

[6] HUNTER W.Of the structure and disease of articulating cartilages.1743[J].Clin Orthop Relat Res，1995(317):3-6.

[7] NAMBA RS,MEULI M,SULLIVAN KM,etal.Spontaneous repair of superficial defects in articular cartilage in a fetal lamb model[J].J Bone Joint Surg Am，1998，80(1):4-10.