NNK抑制ATM基因表达的实验研究

陈俊生，董 琪,曹玉祥，吴志浩

(1.皖南医学院 麻醉学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院 精准医学兴趣小组,芜湖 安徽 241002；3.皖南医学院 临床医学院，安徽 芜湖 241002；4.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000；5.皖南医学院 细胞生物学教研室，生物活性大分子重点实验室，安徽 芜湖 241002)

烟草的使用是全世界主要的公共卫生问题，与烟草有关的癌症每年造成数百万人死亡，其中肺癌患者占绝大多数[1]。4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone，NNK)是烟草中重要的致癌物质，其在体内可被代谢为强致癌物4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮[2]。在细胞中发生了这些复杂的生化反应的结果是NNK广泛地诱导DNA损伤[3-5]。

毛细血管扩张-共济失调突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM) 定位于染色体11q22-23，长度为13 kb，其中含有66个外显子，编码一个13 kb长度的mRNA。其编码产物为ATM蛋白，属于一种丝/苏氨酸蛋白激酶，含有3056个氨基酸残基，是一种分子质量为350 ku大分子量蛋白，ATM是磷脂酰肌醇激酶相关激酶(PIKK)家族的成员，其在DNA双链断裂(DSB)诱导的信号传导中起主要作用[6-7]。在细胞受到DNA双链损伤时，它能被磷酸化激活并启动双链修复阻止细胞周期的进程[4]。因此，研究其活性调控及蛋白表达的机制具有重要的临床意义。目前关于ATM基因表达的相关机制还尚未明确，为了后续探究ATM信号转导的相关分子机制，我们构建了人源ATM基因启动子荧光素酶报告基因质粒，并对其活性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人非小细胞肺癌细胞H1299为本实验室冻存；DMEM培养基(HyClone公司)；小牛血清(南京博全科技有限公司)；polyjet(SignaGen公司)；E.coli DH5α Competent Cells(TaKaRa 公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、PGL3-Basic 质粒(Promega公司)；T4 DNA连接酶、KpnⅠ和NheⅠ(NEWENGLAND BioLabs)；p-ATM、ATM和β-actin抗体以及二抗(CST公司)；DNA Maker、质粒小量提取试剂盒(碧云天公司)；质粒中提试剂盒(QIAGEN公司)；基因组DNA提取试剂盒和Taq PCR MasterMix(TIANGEN公司)；显影液(MILLIPORE公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测ATM蛋白的表达量 适量的细胞接种于六孔板中，用含10%小牛血清的DMEM培养基培养，待长满后以DMEM饥饿12 h，再以1 μmol/L的NNK不同时间段处理(浓度为本实验室前期探索[8])，4 h后收样。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，转膜后，用脱脂牛奶封闭1 h，然后用一抗过夜孵育，再以二抗孵育1 h，最后涂以适量显影液进行成像。

1.2.2 ATM启动子的克隆 H1299细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中。待长满后，用基因组DNA提取试剂盒制备H1299细胞基因组DNA，具体步骤按照操作手册进行。通过UCSC网站，找到人ATM基因启动子序列，设计出一对引物，上游为5′-CCGGTACCCCTGACAGACAAGTGACCCACAAACA-3′，下游为5′-CTAGCTAGCAGAAGCAACGCCAAGCAGCCGCAGAGC-3′。以提取的H1299细胞基因组DNA为模板，PCR条件：预变性94℃、3 min;变性94℃、30 s，退火60℃、30 s，延伸72℃、60 s，共30个循环，延伸72℃、5 min，扩增后的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。将上述克隆的ATM启动子片段和PGL3-Basic分别经KpnⅠ、NheⅠ双酶切、连接，然后进行转化，挑取单克隆菌落做菌落PCR鉴定其阳性的克隆，然后阳性的克隆再次进行摇菌，保种后进行质粒提取、酶切并送往上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 利用GraphPad Prism 6软件对实验中的数据进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATM启动子克隆成功 将扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，出现了预估的条带，说明扩增成功(图1A)。将构建好的质粒进行KpnⅠ、NheⅠ双酶切，出现了两条带，分别与载体和片段的分子量相同(图1B)，上海生工生物工程有限公司的测序结果更加说明了ATM启动子克隆成功。

A：1.PCR扩增产物，M.DNA Maker DL2000。

B：1.所构建质粒的酶切产物，M.DNA Maker DL5000。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.2 NNK对于ATM蛋白的表达有抑制作用 用1 μmol/L的NNK以不同时间段处理H1299细胞，我们发现随着时间的增加，NNK对于ATM的抑制逐渐增强而NNK在3 h和6 h增加了p-ATM的活性，之后随着时间的增加p-ATM的活性减弱，这可能是因为NNK抑制ATM的总蛋白表达量，继而影响到p-ATM的量(图2)。

1 μmol/L的NNK以不同时间段处理的H1299细胞中ATM与p-ATM的表达量。

图2 Western Blot检测结果

2.3 NNK在转录水平上抑制ATM基因的表达 将构建的ATM启动子报告基因转入H1299细胞中，以1 μmol/L的NNK处理4 h，结果显示NNK抑制ATM启动子的活性(图3)。

Control：0.7380 ± 0.0594，n=3；1 μmol/L NNK：0.5015 ± 0.0147，n=3；t=3.865，P=0.0289，差异具有统计学意义。

图3 双荧光素酶报告基因检测系统检测H1299细胞中NNK对ATM启动子活性的影响

3 讨论

我国属于肺癌多发国，多达90%的肺癌可归因于吸烟或二手烟，其中烟草致癌物质NNK已被国际癌症研究机构列为第1类人体致癌物质,吸烟导致肺癌的现状不容乐观。NNK已在体内外的实验中被证明和肺癌的发生与发展密切相关。在动物模型中，NNK是唯一系统诱导小鼠、大鼠以及仓鼠肺部肿瘤的强致癌物。NNK是来源于烟草加工过程中所产生的亚硝胺类物质。在体内，经过细胞色素p450的作用导致了NNK的羟基化，产生了4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，促进了DNA加合物的生成，进而会导致核苷酸的替代、缺失或染色体的重排[9-10]。NNK不仅诱导了DNA的突变，同时可以影响细胞内多种信号通路。研究表明，EGFR、AKT、MAPK、NF-κB 等细胞内重要的信号转导途径都可以被NNK所激活[9]。我们实验室前期的工作发现,NNK可以和尼古丁乙酰胆碱受体结合诱导AKT和ERK1/2信号通路，进而诱导缺氧诱导因子HIF-1α的表达[8,10]。由NNK诱导的DNA突变及染色体变化无疑会导致DNA损伤修复的激活。这与我们发现的p-ATM在NNK处理早期呈上升趋势的结果一致。ATM在细胞内与NBS1以及BRCA1形成BRSC复合物(BRCA1-Associated Genome Surveillance Complex)起到监视DNA损伤的作用。当DNA受到损伤时，ATM蛋白激酶会被磷酸化激活，激活的ATM蛋白激酶会激活下游一系列控制细胞周期的蛋白底物，如p53、chek2、chek1、Nhb1等，以此来使细胞周期停滞，为DNA损伤的修复赢得时间[11]。因此，ATM在修复NNK诱导的DNA损伤中起到关键作用。我们的研究发现，NNK抑制ATM蛋白表达呈时间依赖性，同时我们发现NNK可以在转录水平上抑制ATM启动子的活性。根据本实验室及国内外其他实验室工作的结果，我们推测NNK有可能影响了某个信号通路的功能进而抑制了ATM蛋白的表达，其具体分子机制目前正在加紧研究中。

本项研究证实了NNK对ATM总蛋白的表达有抑制作用，这有可能导致大范围的DNA损伤不能被修复，因此，我们认为NNK抑制ATM是肺癌发生发展的可能机制之一。本实验为探究NNK在非小细胞肺癌细胞中有关ATM信号通路的分子机制奠定了基础，进一步探究NNK对ATM活性及表达的调节对了解烟草如何诱导肺癌的发生具有重要意义，若能更清楚地了解ATM基因和ATM蛋白的功能，可为ATM作为治疗吸烟所致肺癌的新靶点提供更准确可靠的理论依据。

【参考文献】

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