老年雄性大鼠自体移植幼年睾丸组织后血清睾酮水平及间质细胞的变化

张国飞,吴 越,邓 玮,陈安龙,丁兴旺,史 京

(新疆医科大学第六附属医院泌尿外科,乌鲁木齐 830002)

随着人类老龄化的来临，老年人睾酮水平也随之降低，部分老年人因此也会出现睾酮缺乏综合征(testosterone deficiency syndrome，TDS)[1-4]。还有一部分患者因睾丸外伤不能原位移植致使TDS。目前治疗方法有口服和静点睾酮替代治疗，虽取得了较好的效果但都有相关的副反应[5-8]。睾丸组织同种异体移植及异种异体移植已做了大量研究[9],但存在免疫排斥反应，如果针对人类进行此类研究又有违反伦理及法律等方面的问题[10]。大量研究证明，幼年时睾丸间质细胞胞质中细胞器较多，线粒体多，线粒体嵴清晰，可见大量脂滴[11],且幼年睾丸间质细胞有增殖的能力[12]，随着年龄的增长，睾酮合成能力下降。

如果在幼年时留存部分自体睾丸组织在老年时植入体内增加睾丸间质细胞来增加睾酮水平，或者幼年时睾丸外伤无法原位移植，可行自体皮下移植睾丸组织，移植后不引起免疫排斥反应，无需应用免疫抑制剂[13]，从而为部分TDS患者寻找到疗效确切又符合法律和伦理的有效的治疗方法。

本实验在SD大鼠幼年时留存部分自体睾丸组织，冰冻保存，在老年时腋部皮下植入幼年时留存的部分自体睾丸组织，通过血清睾酮水平的测定，探讨睾丸组织自体移植对睾酮的影响。因幼年时睾丸外伤后无法原位移植，冰冻留存睾丸组织，在老年时自体移植睾丸组织，从而为部分TDS患者寻找治疗方法。

1 材料与方法

1.1实验动物本实验选取雄性1月龄SD大鼠20只，体重在80～121 g，平均(104±11.3)g。实验动物来自新疆医科大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(新)2016-0002，生产许可证号:SCXK(新)2016-0003，本实验通过新疆医科大学实验动物伦理委员会审核。用5%苦味酸溶液(黄)和0.5%中性品红溶液(红)标号，每个大鼠均行标号1～20号,每5只1笼，标识不清楚时可补色。养到实验结束。

1.2试剂及实验方法

1.2.1检测1月龄幼年大鼠睾酮并一侧睾丸切除提取睾丸组织 取20只1月龄幼年SD大鼠，行麻醉后先行眼球外侧取血,测睾酮水平，行手术切除右侧睾丸，提取睾丸组织并行-80 ℃冰箱冰冻保存。具体如下：3%戊巴比妥20 mg/kg腹腔注射麻醉后，大鼠仰卧固定。眼部外侧插虹吸管取血，3 500 r/min离心15 min，吸取上层血清，行德国罗氏E601化学发光法试剂盒检测血清性激素水平。均行阴囊右侧切口进入，切开阴囊，切开白膜，暴露右侧睾丸。游离取出右侧睾丸，分离睾丸组织，睾丸组织用DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基加入二甲基亚砜配制冷冻保存液，最终放入-80℃超低温冰箱中保存起来，切口行止血缝合。

1.2.2检测4月龄切除一侧睾丸组织后成年SD大鼠血清睾酮水平 用3%戊巴比妥20 mg/kg腹腔注射麻醉后眼球外侧取血，同样方法离心及检测血清睾酮水平。

1.2.3检测24月龄切除一侧睾丸组织后SD大鼠血清睾酮水平并行自体幼年冰冻睾丸组织皮下移植 SD大鼠至24月龄时行相同方法检测睾酮水平，然后行自体幼年冰冻睾丸组织皮下移植，具体方法为：大鼠24月龄后(即睾丸组织冷冻23月后)，麻醉生效后行右侧腋下切开0.5 cm切口，将冻存的睾丸组织迅速放入37 ℃水浴中不断摇动，使其在1 min之内解冻，迅速进行腋下切口下组织移植。然后缝合腋下皮肤。

1.2.4检测25及26月老龄SD大鼠血清睾酮水平 用3%戊巴比妥20 mg/kg腹腔注射麻醉后眼球外侧取血，同样方法离心及检测血清睾酮水平。

1.2.5检测睾丸间质细胞情况 取移植前冰冻睾丸组织行10%甲醛溶液固定，24 h后将固定组织放入包埋框中做好标记进行脱水及石蜡包埋。制成5 μm切片，然后行HE染色。最后行高倍显微镜下观察睾丸间质细胞情况。同样方法制作切片观察移植后1月及2月睾丸间质细胞情况。

2 结 果

20只大鼠中，5号大鼠在1月龄时一侧睾丸组织切除后3 d死亡，11号大鼠在24月后自体移植睾丸组织后5 d死亡。1月龄SD大鼠血清睾酮水平为(0.067 0±0.031 81) ng/mL；切除一侧睾丸组织4月龄SD大鼠睾酮水平为(2.695 0±0.293 18) ng/mL；切除一侧睾丸组织24月龄SD大鼠睾酮水平为(1.584 2±0.43119)ng/mL；切除一侧睾丸组织自体睾丸组织移植后25月龄SD大鼠血清睾酮水为(1.789 5±0.298 99)ng/mL；切除一侧睾丸组织并自体移植后26月龄SD大鼠血清睾酮水为(1.516 8±0.413 82)ng/mL。各组样本方差齐性检验均为正态分布,相关干预后各月龄段SD大鼠睾酮水平两两比较如表1所示。

冰冻睾丸组织移植前睾丸间质细胞情况，移植后1月及2月睾丸间质细胞情况(如图1)：冰冻睾丸组织移植前睾丸间质细胞较多，移植后1月睾丸间质细胞有减少趋势，在2月后睾丸间质细胞绝大多数凋亡。

表1相关干预后各月龄段SD大鼠睾酮水平两两比较

相比较的月龄段均值差(I⁃J)标准误显著性95%置信区间下限上限1月4月-2．62800∗0．102970．000-2．8324-2．423624月-1．51715∗0．102970．000-1．7216-1．312725月-1．72250∗0．102970．000-1．9269-1．518126月-1．44984∗0．104310．000-1．6570-1．24274月1月2．62800∗0．102970．0002．42362．832424月1．11085∗0．102970．0000．90641．315325月0．90550∗0．102970．0000．70111．109926月1．17816∗0．104310．0000．97101．385324月1月1．51715∗0．102970．0001．31271．72164月-1．11085∗0．102970．000-1．3153-0．906425月-0．20535∗0．102970．049-0．4098-0．000926月0．067310．104310．520-0．13980．274425月1月1．72250∗0．102970．0001．51811．92694月-0．90550∗0．102970．000-1．1099-0．701124月0．20535∗0．102970．0490．00090．409826月0．27266∗0．104310．0100．06550．479826月1月1．44984∗0．104310．0001．24271．65704月-1．17816∗0．104310．000-1．3853-0．971024月-0．067310．104310．520-0．27440．139825月-0．27266∗0．104310．010-0．4798-0．0655

*均值差的显著性水平为0.05。

图2 睾丸组织移植前后睾丸间质细胞变化情况(HE，×200)

3 讨 论

理论上，提高睾酮水平的方法有提高垂体功能及提高睾丸功能均可改善睾酮的产生。艾灸、电针、运动等可能刺激脑部垂体释放促性腺激素从而提高睾酮水平[14-15]，口服和静脉点滴睾酮激素是治疗TDS的有效方法。目前大量证据表明，TDS患者口服雄激素药物可以获得多种益处，包括情绪、精力状态、幸福感、性功能、肌肉量和肌力、贫血、骨密度、认知功能以及某些心血管危险因素的改善等，而且这种获益在老年和年轻患者中无显著性差异[16-17]。但是可能也存在如下缺点[18]：①患者依从性差不能按时使用药物；②激素补充使体内24 h雄激素浓度不均衡，不能有效模拟生理浓度，从而抑制下丘脑-垂体-睾丸性腺轴的功能，可能使垂体功能及睾丸功能减弱。垂体功能减弱又进一步减弱垂体相关激素，从而影响其他系统的正常功能；③诱发心脏意外；④红细胞增多症；⑤睡眠呼吸暂停；⑥药物治疗需要长期服用费用昂贵。

老年雄性SD大鼠自体移植幼年时睾丸组织后血清睾酮水平在1月内睾酮水平稍有增长，但随着时间的推移，睾酮水平进行性下降，我们分析有如下可能原因：①睾酮移植部位血供较差，使睾丸生精功能及释放睾酮能力下降[19]； ②睾丸移植部位温度较高，不能有效模拟阴囊部位的生长环境，使睾丸生精功能及释放睾酮能力下降；③腋下自体移植睾丸组织可能会排异反应；④睾丸组织种植到腋下脂肪层创面上，本身会产生疤痕修复及炎细胞聚集，也会使吞噬细胞吞噬睾丸间质细胞，使睾丸组织释放睾酮能力下降；⑤老年雄性大鼠垂体功能下降致使促性腺激素下降进一步使睾丸功能下降；⑥大鼠自体移植幼年时冰冻睾丸组织可能也有一定的免疫排斥反应使睾丸间质细胞增殖受限。⑦睾丸组织用DMEM培养基加入二甲基亚砜配制冷冻保存液，最终放入-80℃低温冰箱中保存起来不能有效保证睾丸组织的活性。总结改进方法：①今后能否行睾丸组织移植在阴囊内，模拟睾丸生长的原始环境；②能否把睾丸组织移植到肌层血供丰富区，使睾丸组织得到充足的营养，增加睾丸组织的活性；③能否行注射器大针头注射睾丸组织，使移植部位创伤较小，以免疤痕细胞集聚较多影响睾丸组织释放睾酮；④今后能否选择更好的保存液及液氮保存使在更低的温度保存。

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