慢性乙型肝炎患者血清IL-17表达水平及其调控IL-6/STAT3信号通路的研究

柳雅慧，任丽，邵洁，侯永旺，常娇

乙型肝炎病毒（HBV）是最常见的肝炎病毒，严重危害人类健康。据估计全世界有 3.5 亿人为慢性乙型肝炎（CHB）感染者。当 HBV 感染人体后，人体免疫系统启动多种免疫反应以清除或减弱HBV 对人体的损害。T 辅助细胞 17（Th17）是发挥促炎活性的新兴 T 细胞亚群，主要分泌 IL-17。IL-17 与其受体结合后可以诱导 IL-6、IL-1、TNF-α等炎性细胞因子与趋化因子的分泌，促进炎症反应[1]。最近的研究发现，IL-17 广泛参与慢性肝病的肝脏损伤[2]，同时 IL-17 的表达与慢性乙型肝炎炎症活动度及肝纤维化程度呈显著正相关[3]，但IL-17 在 CHB 患者中的调控机制尚未明确。

本文拟在探究 IL-17 在 CHB 患者中的表达水平，以及其是否通过调控 IL-6/STAT3 信号通路参与肝炎疾病的进展，从而探究 IL-17 在 CHB 疾病中的意义。

1 材料与方法

1.1 对象及材料

1.1.1 对象 在患者的知情同意下，收集 50 例CHB 患者全血并分离血清，–80 ℃ 保存备用。实验组入选标准：乙型肝炎病毒抗原（HBsAg）阳性。排除标准：甲、丙、丁、戊型肝炎患者，获得性免疫缺陷综合征患者，自身免疫性疾病患者以及患有其他慢性肝脏损害疾病患者，接受保肝及抗病毒治疗患者。选取同一时期 50 名性别和年龄与实验组匹配的门诊健康体检者作为对照受试者。回顾性收集入选对象临床特征与病毒学特征信息。

1.1.2 试剂 I2000 配套试剂购于美国雅培公司；胎牛血清、DMEM 培养基均购于美国 Gibco 公司；遗传霉素（G418）购于德国 Merck 公司；IScriptTMcDNA 合成试剂盒购于美国 Bio-Rad 公司；ELISA 试剂盒购于中国武汉基因美生物科技公司；细胞裂解缓冲液（RIPA）购于北京索莱宝公司；蛋白定量分析试剂盒购于美国 Thermo 公司；硝酸纤维素膜购于英国 GE Healthcare 公司；抗体购于英国 Abcam 公司；电化学发光法（ECL）蛋白质印迹试剂购于美国 Millipore 公司。

1.1.3 仪器 PE9700 实时荧光定量检测仪为美国 PE公司产品；全自动生化分析仪 AU5800 为美国 Beckman 公司产品；Roche E170 电化学发光免疫分析仪为瑞士 Roche 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 生化指标检测 采用美国雅培 I2000 及配套试剂检测乙型肝炎病毒标志物 HBsAg、HBeAg、HBcAb（化学发光法）；采用 PE9700 实时荧光定量检测仪以及配套试剂检测血清 HBV-DNA 含量；采用全自动生化分析仪 AU5800 以及配套试剂连续监测法检测 ALT、AST，重氮试剂法检测总胆红素、直接胆红素，双缩脲法检测总蛋白，溴甲酚绿法检测白蛋白；采用电化学发光法检测甲胎蛋白含量，严格按照仪器和试剂说明书进行操作，质量控制结果均在控。

1.2.2 细胞培养 HepG2.2.15 细胞培养于含有10% 胎牛血清和 400 μg/ml 遗传霉素（G418）的DMEM 培养基中；在含 5% CO2，37 ℃ 孵育箱中培养。参考文献[4]的研究方法，将细胞接种于 6 孔板中并用不同浓度（0、40 ng/ml）的 rhIL-17处理。根据 HBV 一个复制周期约为 48 h，常用的检测时间点为 3 d，所以当 rhIL-17 处理3 d 后，收集细胞以及细胞上清。

1.2.3 实时荧光定量 PCR 利用IScriptTMcDNA合成试剂盒将提取的 RNA 逆转录为 cDNA。使用Fast Start Universal SYBR Green Master 进行 IL-6 mRNA 的相对定量，并将 β-actin mRNA 用作内参。用 2-ΔΔCT方法计算靶基因的倍数变化。实验引物的序列如下：IL-6 mRNA 上游引物 5' TCCAAA GATGTAGCCGCCC 3'，下游引物 5' CAGTGCCTC TTTGCTGCTTTC 3'；β-actin 上游引物 5' CTCTTC CAGCCTTCCTTCCT 3'，下游引物 5' AGCACTGT GTTGGCGTACAG 3'。

1.2.4 酶联免疫吸附法 根据生产商的说明书，通过 IL-17、IL-6 ELISA 试剂盒分别测定 CHB 患者血清中 IL-17 水平以及细胞上清中 IL-6 浓度。1.2.5 蛋白免疫印迹 收集细胞并用适当体积的含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液（RIPA）裂解细胞。通过蛋白定量分析试剂盒定量蛋白质，含有 30 μg 总蛋白的裂解物在 99 ℃ 变性 10 min。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过电湿转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜。将含有目的蛋白质的膜用 5% 脱脂牛奶封闭 1 h，并在 4 ℃ 下与一抗（STAT3 1:2000；pSTAT3 1:2000；Actin 1:10000）一起温育过夜。第2 天，将膜在含有吐温-20 的三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS-T）中洗涤 5 min，并重复 3 次。与二抗（1:10000 稀释）在室温下孵育 1 h。用电化学发光法蛋白质印迹试剂显示条带。肌动蛋白（Actin）为对照。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。采用中位数及四分位数间距表示受试者的临床特征以及病毒学特征，两组之间的差异通过Manne-Whitney 秩和检验来评估。采用 Spearman相关分析方法分析 IL-17 与 HBV-DNA、ALT 及AST 之间的相关性。采用t检验分析 rhIL-17 未处理细胞组与处理细胞组之间的差异。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

表1 受试者基本临床及病毒学特征（n = 50）Table 1 Clinical and virological characteristics of the subjects enrolled in the study (n = 50)

2 结果

2.1 CHB 患者和健康对照者的临床以及病毒学特征

收集了 50 名 CHB 患者和 50 名年龄和性别匹配的健康对照者的临床和病毒学特征，具体数据见表 1。血清 ALT、AST、总胆红素、直接胆红素、甲胎蛋白在 CHB 患者组中明显高于健康对照组，血清总蛋白、白蛋白在CHB 患者组中明显低于健康对照组。

2.2 IL-17 与 HBV 的相关性

与健康对照组相比，CHB 患者组血清中 IL-17的水平明显升高（图 1A），同时我们发现 CHB 患者血清中 IL-17 与 HBV-DNA 水平[log10（HBV DNA）]呈正相关性（图 1B）。

2.3 IL-17 与肝脏损伤指标 ALT、AST 之间的相关性

将CHB 患者血清 IL-17 水平与血清中 ALT、AST 浓度进行相关性分析发现，IL-17 水平与ALT、AST 浓度呈显著的正相关性（图 2A、B）。

2.4 IL-17 参与并激活 IL-6/STAT3 信号通路

将能进行 HBV 复制的 HepG2.2.15 细胞系用 rhIL-17 处理 3 d 后，检测细胞中 IL-6 mRNA以及上清中 IL-6 蛋白的表达水平，发现用 rhIL-17处理细胞后，IL-6 表达水平明显上调（图 3A、B）。同时我们发现磷酸化的 STAT3 在用 rhIL-17 处理后表达水平也明显上调（图 3C）。

图1 IL-17 与 HBV 相关性（A：健康对照组与 HBV 患者组中血清中 IL-17 浓度；B：CHB 患者血清中 IL-17浓度与HBV-DNA 水平之间的相关性）Figure 1 The relationship between the level of IL-17 and HBV (A: The serum levels of IL-17 in healthy control and chronic HBV patients; B: The correlation between IL-17 levels and the concentrations of HBV-DNA in CHB patients)

图2 IL-17 水平与肝脏损伤指标 ALT（A）和 AST（B）浓度之间的相关性Figure 2 The correlations between IL-17 level and the concentrations of ALT (A) and AST (B) were analyzed by Spearman’s rank test

图3 IL-17 参与并激活 IL-6/STAT3 信号通路（A：IL-6 mRNA 在未用 rhIL-17 处理细胞组以及用 40 ng/ml rhIL-17 处理细胞组中的相对表达量；B：收集未用 rhIL-17 处理细胞组以及处理组的细胞上清，采用 ELISA 法检测 IL-6 蛋白的表达水平；C：收集未用 rhIL-17 处理细胞组以及处理组的细胞，检测细胞中 STAT3、pSTAT3 蛋白的表达水平）Figure 3 IL-17 is involved in and activates the IL-6/STAT3 signaling pathway (A: Relative real-time PCR was performed to determine the level of IL-6 mRNA after 3 days treatment; B: ELISA was performed to determine the level of IL-6 protein after 3 days treatment; C: Western blot was performed to determine the level of STAT3 protein and pSTAT3 protein after 3 days treatment)

3 讨论

乙型肝炎是一种分布范围广、感染率高、难治愈的疾病，严重危害人类健康。HBV 感染人体后可诱发免疫反应间接损害肝细胞。其中在机体免疫过程中，Th17 细胞在 HBV 感染的发病机制中起重要作用[5]，而 IL-17 是 Th17 细胞分泌起主要免疫作用的细胞因子。研究发现 IL-17 与 CHB 患者之间具有相关性，但具体的机制尚无明确报道，因此在本文中，我们探究了 IL-17 在 CHB 患者中的表达水平以及其与 IL-6/STAT3 信号通路的关系。

我们的研究发现，与健康对照组相比，IL-17 在CHB 患者中明显升高，表明 IL-17 与 CHB 患者之间具有相关性，将 IL-17 与 CHB 患者血清中HBV-DNA 进行相关性分析发现，两者呈明显的正相关性，提示升高的 IL-17 可以抑制机体对 HBV的免疫清除作用，IL-17 可能参与了 HBV 感染时HBV 的复制与表达，导致 CHB 患者免疫系统功能紊乱加重，从而引起肝脏损伤加重。有学者同样发现 IL-17 在 CHB 患者中明显升高，导致患者肝功能受损[3]。我们还发现 IL-17 与肝脏损伤指标ALT、AST 之间呈显著的正相关性，说明随着 CHB患者肝功能受损程度的增强，IL-17 水平变化显著。Zhang 等[6]发现 IL-17 阳性的细胞在 CHB 患者的肝脏小叶和门静脉区的表达水平与健康对照组相比明显升高，并随着肝脏损伤强度的增强而表达增高。以上结果表明，IL-17 协同其他促炎因子，加剧肝脏炎症微环境，参与 HBV 的复制，在 CHB患者疾病进展中发挥重要作用。

IL-17 不仅在 CHB 患者疾病中发挥重要作用，同时有研究发现，IL-17 可以参与 HBV 相关的肝硬化、肝癌的进展[7-8]。在我们的研究中发现，rhIL-17 作用于能进行 HBV复制的细胞时，检测到 IL-6 mRNA 以及蛋白水平上调；而 IL-6 可调控Th17 细胞的分化，促进 Th17 细胞分泌 IL-17[9]，这样 IL-17 与 IL-6 之间通过相互促进作用，共同调控机体的免疫反应。同时 IL-6 可介导肝癌细胞中 STAT3 的激活，活化的 STAT3 可介导抗凋亡，促进增殖和促进血管生成的发生[10]。在此研究背景下，我们发现能进行 HBV 复制的细胞在 rhIL-17作用后，pSTAT3 水平显著升高，pSTAT3 可能通过抗凋亡、促进增殖的功能参与 HBV 持续在体内复制的过程。同时有研究发现 IL-17 通过激活IL-6/STAT3 信号通路还可促进肝癌的侵袭与转移[4]。以上结果表明，IL-17 参与并激活 IL-6/STAT3 信号通路，与 CHB 疾病的进展密切相关。

综上所述，我们发现 IL-17 在 CHB 患者中明显升高，同时 IL-17与 HBV-DNA 病毒载量之间呈正相关性，并且 IL-17 参与并激活 IL-6/STAT3信号通路，从而与 HBV 复制及 CHB 疾病的进展密切相关。因此，通过降低患者体内 IL-17 的表达水平，或者阻断 IL-6/STAT3 信号通路对于控制慢性乙型肝炎的进展极有可能具有非常重要的作用，为未来 CHB 患者的治疗提供了新的思路。本文存在样本量偏小的局限性，并且 IL-17 参与 HBV 复制的详细机制，如是否通过促进 HBV 复制中间体、前基因组 RNA 的表达而促进 HBV 复制等，还需要进一步的研究。

[1] Kolls JK, Lindén A. Interleukin-17 family members and inflammation.Immunity, 2004, 21(4):467-476.

[2] Lafdil F, Miller AM, Ki SH, et al. Th17 cells and their associated cytokines in liver diseases. Cell Mol Immunol, 2010, 7(4):250-254.

[3] Wang L, Chen S, Xu K. IL-17 expression is correlated with hepatitis B-related liver diseases and fibrosis. Int J Mol Med, 2011, 27(3):385-392.

[4] Gu FM, Li QL, Gao Q, et al. IL-17 induces AKT-dependent IL-6/JAK2/STAT3 activation and tumor progression in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer, 2011, 10:150.

[5] Wu W, Li J, Chen F, et al. Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients.J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(4):750-757.

[6] Zhang JY, Zhang Z, Lin F, et al. Interleukin-17-producing CD4(+) T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B. Hepatology, 2010, 51(1):81-91.

[7] Du WJ, Zhen JH, Zeng ZQ, et al. Expression of interleukin-17 associated with disease progression and liver fibrosis with hepatitis B virus infection: IL-17 in HBV infection. Diagn Pathol, 2013, 8:40.

[8] Liao R, Sun J, Wu H, et al. High expression of IL-17 and IL-17RE associate with poor prognosis of hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res, 2013, 32:3.

[9] Zhou L, Ivanov II, Spolski R, et al. IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat Immunol, 2007, 8(9):967-974.

[10] Yu H, Kortylewski M, Pardoll D. Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment. Nat Rev Immunol, 2007, 7(1):41-51.