补肾调经方和逍遥丸对超促排卵小鼠子宫内膜细胞Wnt通路的影响

杨丽芸，程长云，刘昱材，贾蕊，张瑞娟，杜惠兰

胚胎质量和子宫内膜容受性是胚胎成功着床的关键因素。体外受精-胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET）技术是治疗不孕症的主要手段，募集较多卵泡并通过促性腺激素的应用可以获得较多高质量卵子[1]，但临床妊娠率却一直未能尽如人意，研究表明，控制性超促排卵中大量雌孕激素的应用会影响子宫内膜形态和容受性[2]，子宫内膜容受性的损害所致的着床失败占到 2/3，是导致 IVF-ET 失败的主要原因之一[3]。经典 Wnt 信号通路在雌性哺乳动物生殖系统发育中作用重要，研究表明，多种 Wnt 信号蛋白在雌孕激素调节下，可参与胚泡着床[4]。本课题前期研究表明，补肾法、疏肝法虽然对生殖功能的影响机制不同，但均能调节卵巢功能，提高卵母细胞质量，增加子宫内膜厚度，改善子宫内膜容受性并提高临床妊娠率[5-7]。因此，补肾法、疏肝法是否通过干预Wnt/β-catenin 通路相关因子影响胚胎着床？其机制有何差异值得探讨。因此，本研究选取课题组经验方补肾调经方和逍遥丸分别作为补肾法和疏肝法的代表方剂，对比研究两种方法对小鼠子宫内膜Wnt 通路的关键调节因子 Wnt7a 和 β-catenin 的影响，以探讨两者作用机制的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级、健康、雌性昆明小鼠90 只，6 ～ 7 周龄，体重 28 ～ 32 g；健康雄性昆明小鼠 90 只，8 ～ 9 周龄；均购自河北实验动物中心，动物合格证号：1612191。雌、雄分笼饲养，自由饮水和进食，饲养室温度保持在（20 ± 1）℃，相对湿度约 50%，自动控制光照 12 h，黑暗 12 h。

1.1.2 药物与试剂 补肾调经方包括熟地黄 20 g、当归 9 g、山药 12 g、山茱萸 15 g、女贞子 9 g、枸杞子 12 g、紫河车 10 g、淫羊藿 10 g、菟丝子12 g、覆盆子 10 g、香附 6 g、白芍 9 g、肉苁蓉10 g、丹参 10 g，均购自石家庄乐仁堂，经河北中医学院中药系制成口服液，高剂量含生药 5.4 g/ml，低剂量含生药 2.7 g/ml，分别相当于临床用药量（0.81 g/ml）的 20 倍和 10 倍；逍遥丸由河南宛西制药股份有限公司生产，将 200、100 粒逍遥丸分别溶于 125 ml 蒸馏水中制成混悬液，高剂量含生药 0.6 g/ml，低剂量含生药 0.3 g/ml，置 4 ℃ 冰箱中备用；孕马血清（PMSG）购自上海市计划生育科学研究所；人绒毛膜促性腺激素（HCG）购自丽珠制药厂。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 将 90 只雌性小鼠适应性饲养 1 周后，按照随机数字表法完全随机化分为 6 组：补肾高剂量组、补肾低剂量组、疏肝高剂量组、疏肝低剂量组、控制性超促排卵组（COH）和空白对照组，每组 15 只。各组每日腹腔注射生理盐水，连续 8 d，至第9 天早 9 时空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组同时注射 PMSG 10 IU/只。48 h 后空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射 HCG 10 IU/只。当晚各组分别与雄鼠按 1:1 进行合笼，次日晨 8 时检查阴栓，观察到阴栓者记为妊娠第1 天。于妊娠第1 ～4 天，补肾高、低剂量组分别给予补肾调经方口服液（5.4 和 2.7 g/ml）；疏肝高、低剂量组分别给予逍遥丸混悬液（0.6 和 0.3 g/ml）；对照组和 COH组每天灌服生理盐水。各组小鼠均以 1 ml/100 g 灌胃，连续给药 4 d。

1.2.2 标本采集 妊娠第4 天晚 10 点每组小鼠于尾静脉注射 0.2 ml 体积分数 0.5% 的伊文思蓝，摘除眼球法取血 3 ml，（24 ± 2）℃ 静置 2 h 后3000 r/min 离心 3 min，取血清置于 –20 ℃ 冰箱中保存。各组小鼠取血后脱颈椎处死。剖腹取子宫并分离，生理盐水漂洗后，将每只小鼠的子宫左右角分开，一半子宫固定于体积分数为 4% 的多聚甲醛溶液中，脱水并石蜡包埋，用于免疫组化检测，另一半 –80 ℃ 保存，以备检测 mRNA。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 子宫内膜形态结构观察 选取各组小鼠胚泡着床部位子宫组织，制备 HE 切片，光镜下观察小鼠子宫内膜组织的形态学变化。

1.2.3.2 RT-PCR 取 100 mg 组织按照试剂盒说明提取总 RNA，并进行相关浓度及纯度的测定定量；取总 RNA 2 μg，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应；目标基因 mRNA 拷贝数用 GAPDH作为内参校正，引物序列及退火温度分别为：β-catenin（438 bp）：上游引物：5' ATCTTAAGCCC TCGCTCGGT 3'，下游引物：5' TTGCTCTTGCGT GAAGGACT 3'，退火温度 55 ℃；Wnt7a（283 bp）：上游引物：5' GAATGGCGTGTGTGTGATGG 3'，下游引物：5' CTGGTAACTGCTATGGCCCC 3'；GAPDH（615 bp）：上游引物：5' GACCACAGTCC ATGCCATCA 3'，下游引物：5' CCCTAGGCCCCT CCTGTTAT 3'。PCR 反应体系振荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于 PCR 仪扩增。扩增条件为：94 ℃ 变性 3 min，30 个循环；72 ℃ 延伸 10 min；然后取每个标本的扩增产物 6 μl 于 1% 的含 GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以 DNA marker（DL2000）作为标准片段标记，电泳之后于紫外透射仪观察，照相后应用 Quantity One 凝胶图像分析软件对目的电泳条带进行分析，并以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者的积分吸光度的比值表示。

1.3 统计学处理

采用 SPSS23.0 软件包进行统计学处理。计量资料用±s表示，若满足正态性及方差齐性，多组间比较用单因素方差分析，否则用秩和检验；P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠子宫内膜形态变化

空白对照组腺体多，腺腔大而饱满，间质疏密均匀，血管丰富。COH 组可见腺体减少，腺腔小，间质致密。经补肾调经方和逍遥丸治疗后，各高剂量组腺体增多，间质疏密较均匀，血管较丰富；各低剂量组较 COH 组腺体数量增加，间质略均匀，但整体状况略逊于高剂量组（图 1）。

2.2 各组小鼠子宫 Wnt7a 和 β-catenin mRNA 表达情况

与空白对照组比较，Wnt7a 和 β-catenin 基因在 COH 组表达降低（P＜ 0.05）；与 COH 组比较，补肾高剂量组和疏肝高剂量组表达增加，差异具有统计学意义（P＜ 0.05），补肾低剂量组和疏肝低剂量组表达增加，但无统计学意义（P〉 0.05）。补肾高剂量组与疏肝高剂量组间比较无统计学意义（P〉0.05）（图 2 和表 1）。

3 讨论

图1 各组小鼠子宫内膜形态（A：空白对照组；B：COH 组；C：补肾低剂量组；D：补肾高剂量组；E：疏肝低剂量组；F：疏肝高剂量组）（× 400）Figure 1 Endometrial morphology of mice in each group (A: Blank control group; B: COH group; C: Bushen low dose group; D:Bushen high dose group; E: Shugan low dose group; F: Shugan high dose group) (× 400)

图2 各组小鼠子宫 Wnt7a 和 β-catenin mRNA 表达情况Figure 2 Expression of Wnt7a and β-catenin mRNA in the mice womb in each group

表1 各组小鼠子宫 Wnt7a 和 β-catenin mRNA比较（± s ）Table 1 Relative level of Wnt7a and β-catenin mRNA in the mice womb (± s )

表1 各组小鼠子宫 Wnt7a 和 β-catenin mRNA比较（± s ）Table 1 Relative level of Wnt7a and β-catenin mRNA in the mice womb (± s )

注：与空白对照组比较，*P ＜ 0.05；与控制性超促排卵组比较，△P ＜ 0.05；与补肾低剂量组比较，#P ＜ 0.05；与补肾高剂量组比较，▲P ＜ 0.05；与疏肝低剂量组比较，□P ＜ 0.05；与疏肝高剂量组比较，▽P ＜ 0.05。Notes: Compared with the blank control, *P ＜ 0.05; compared with the COH, △P ＜ 0.05; compared with bushen low dose group, #P ＜ 0.05; compared with bushen high dose group, ▲P ＜ 0.05; compared with shugan low dose group, □P ＜ 0.05; compared with shugan high dose group, ▽P ＜ 0.05.

组别 Groups n Wnt7a mRNA β-catenin mRNA空白对照 Blank control 15 1.066 ± 0.007△□▽#▲ 0.788 ± 0.050△□▽#控制性超促排卵 COH 15 0.601 ± 0.079*▽▲ 0.466 ± 0.021*▽▲补肾低剂量 Bushen low dose 15 0.712 ± 0.080* 0.545 ± 0.041*▲补肾高剂量 Bushen high dose 15 0.814 ± 0.076*△□ 0.693 ± 0.082△#□疏肝低剂量 Shugan low dose 15 0.684 ± 0.058*▲▽ 0.520 ± 0.049*▲疏肝高剂量 Shugan high dose 15 0.816 ± 0.048*△□ 0.619 ± 0.072*△

子宫内膜容受性受到众多细胞因子、蛋白及基因的调控，而外源性促性腺激素的应用可导致内分泌激素分泌失衡，子宫内膜血供状态、厚度、细胞因子等多因素改变，最终导致妊娠失败。Wnt 信号通路是生物体内的一条最基本的、保守的信号转导通路，受多种 Wnt 配体、卷曲蛋白（FZD）和低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）受体以及下游效应因子调控，是调控细胞生长分化的关键途径。经典 Wnt 信号途径（Wnt/β-catenin）与胚胎着床关系密切，Wnt 配体通过与 FZD 和 LRP 形成三聚体，而后将信号传导给蓬乱蛋白，从而阻止糖原合酶激酶 3β 对 β-catenin 的磷酸化和降解，使其在胞质中大量聚集，转入核内与 T 细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）结合激活靶物质的表达。已有研究表明，经典 Wnt 信号通路与子宫内膜增殖、分化、蜕膜化及胚胎植入关系密切[8-9]，该信号通路的激活是胚胎着床过程中所必需的[10]。多种 Wnt信号蛋白在雌孕激素调节下，可参与子宫内膜分化和胚胎着床[4]。Wnt7a 为 Wnt 配体之一，对小鼠子宫发育及腺体形成至关重要[11]，可调控子宫上皮细胞的发育和分化[12]。研究表明，小鼠子宫内膜中Wnt7a mRNA 在妊娠 4 d 子宫腔上皮大量表达[13]，并且在动情周期中随激素水平的变化而变化[14]；而Wnt7a 基因敲除小鼠表现为子宫内膜腺体缺乏及子宫平滑肌层排列紊乱，影响胚胎着床[15-16]，且间质中 Hox10/11 基因表达缺失[11]，而 Hox10/11 基因在胚胎植入、间质蜕膜化过程中有重要作用[17]。因此，Wnt7a 可能通过经典 Wnt/β-catenin 参与建立子宫内膜上皮细胞与间质间的信号联系，并且在着床窗口期介导了胚胎植入过程[18]。β-catenin 是Wnt 信号通路核心分子，参与细胞黏附和转录活性的调节，是信号通路被激活的标志性物质。研究表明，β-catenin 的异常表达会影响子宫内膜的蜕膜化，从而导致着床失败[19]，而 Wnt7a 可通过上调子宫上皮细胞核内的 β-catenin 水平，激活Wnt/β-catenin 信号转导通路，并激发胚胎植入的相关反应，从而改善胚胎着床的成功率[20]。

近年，中药在改善子宫内膜容受性方面取得了较大的进步[21-22]。补肾调经方为本课题组临床应用多年的经验方，由养精种玉汤合五子衍宗丸化裁而成，方中熟地黄滋补肝肾，养血填精，为君药；山茱萸、肉苁蓉、山药、女贞子、枸杞子助熟地黄补益真阴、滋肾添精，紫河车、覆盆子、淫羊藿、菟丝子助君药补肾助阳，共为臣药；当归、白芍、丹参三药养血活血，滋阴柔肝，配以香附行气开郁，助行血运，共为佐药；诸药合用，共奏滋阴补肾，养血调经，种子育胎之效，正如《傅青主女科》“精满则子宫易于摄精，血足则子宫易于容物，皆有子之道也”的理论思想。逍遥丸作为疏肝法代表方剂，源于《太平惠民和剂局方》，方中柴胡疏肝调经，当归、白芍可养血敛阴，茯苓、白术、甘草可化气血以敛肝阴，诸药合用，以调畅冲任，以达调经种子之效。

本研究显示，与 COH 组比较，各治疗组子宫组织形态变化明显，内膜相对较厚，间质疏松，腺体丰富；补肾高剂量组和疏肝高剂量组 Wnt7a 和β-catenin 表达较 COH 组明显增加，而各低剂量组表达无统计学意义，说明补肾调经方和逍遥丸可能是通过上调小鼠子宫 Wnt7a 表达，进而提高β-catenin 表达水平，激活 Wnt/β-catenin 信号转导通路，来改善子宫内膜形态，调控子宫内膜容受性，促进胚胎着床，并且存在剂量关联性，高剂量效果更佳。而补肾高剂量组与疏肝高剂量之间比较无统计学意义，提示补肾法和疏肝法在调控 Wnt7a 和β-catenin 表达方面无差异，两法激活 Wnt 经典通路的机制和作用途径相似。本研究为临床 IVF-ET过程中配合应用补肾法和疏肝法提供了实验基础，有利于提高 IVF-ET 临床妊娠率。

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