脂蛋白相关磷脂酶A2表达与动脉粥样硬化进程相关性研究

黄立纲，刘炼华，刘航齐，贾玫

心血管疾病已经成为全球全因死亡的首要病因，且呈逐年上涨的趋势，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是其病理基础。Lp-PLA2 是近年来引起广泛关注的磷脂酶超家族成员，与心血管疾病密切相关，被认为是冠心病（coronary artery disease，CAD）独立的风险预测因子[1]，大量研究表明 Lp-PLA2 可促进 AS 发展，为诊断及预防心血管事件的发生提供了新的手段。

Kolodgie 等[2]在冠状动脉事件猝死患者尸检解剖中发现，在坏死中心巨噬细胞易损和破裂斑块的周围 Lp-PLA2 高表达，损害较轻的脂质池Lp-PLA2 水平较低，可见随着斑块的进程，斑块组织中 Lp-PLA2 表达逐渐升高。朱雁洲等[3]通过检测急性冠状动脉综合征患者、稳定型心绞痛患者和排除冠心病者的 Lp-PLA2 水平和血管内超声虚拟组织学（intravascular ultrasoundvirtual histology，IVUS-VH）冠状动脉斑块特征也得出相似结论，可见 Lp-PLA2 在动脉粥样硬化的发生发展中的重要作用，且与斑块的性质相关。

载脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）是血浆脂蛋白的重要成分，对脂质的运输和代谢发挥主要作用，在 AS 的发生发展中起着关键性的作用。ApoE 基因缺陷小鼠可自发形成 AS 病变，与在人体内的发展过程极为相似[4]。利用该模型观测 AS进展过程中各种炎症因子的浓度变化及作用和Lp-PLA2 在组织中的分布变化，可为临床早期 AS的预防、诊断及病情评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

1.1.1 主要仪器 LST008 全自动生化分析仪由日本 Hitachi 公司生产；伯乐 680 酶标仪由美国Bio-Rad 公司生产。

1.1.2 主要试剂 ApoE 基因敲除小鼠、高脂饲料由北京华阜康生物科技有限公司提供；TC 酶法检测试剂盒、TG 酶法检测试剂盒均由美国 Beckman Coulter 公司提供；HCY 循环酶法检测试剂盒由北京柏定生物工程有限公司提供；Lp-PLA2 活性测定试剂盒由德国 DiaSys 公司提供；抗小鼠 CRP ELISA 方法试剂盒、抗小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒由美国 R&D 公司提供；兔抗小鼠 Lp-PLA2 单克隆抗体由美国 Proteintech 公司提供；免疫组化二抗试剂盒由上海基因科技有限公司提供；山羊血清原液由北京索莱宝科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养方案 参照文献[4]，设计动物饲养方案。6 周龄 ApoE 基因缺陷小鼠（品系C57BL/6J）55 只，全部为雄性，饲养于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级、免疫缺陷动物专用饲养间。每笼 5 只小鼠，饲料、饮水供应充足。随机选取 45 只做实验组，饲以含脂肪21%、胆固醇 0.15%（以重量计）的高脂饲料（灭菌照射处理）；其余 10 只为对照组，饲以一般饲料，小鼠均为自由采食。

1.2.2 AS 的观察 自第20 周（周龄）起，每隔2 周随机选取 2 只实验组小鼠，面静脉取血约1 ml 至 EP 管，随后断颈处死，解剖暴露心脏。磷酸盐缓冲液（PBS）灌注洗去血管中的血细胞，随后注入 4% 甲醛固定液，小心剥离主动脉。进行石蜡包埋，切片厚度为 4 μm，苏木精伊红（HE）染色，观察主动脉根部及主动脉弓小弯处等好发部位AS 斑块形成情况。在镜下观察到脂质核形成时判定 AS 模型建立成功，自此每周选取 3 只实验组小鼠、每隔 3 周选取 3 只对照组小鼠，取血并断颈处死取主动脉，做石蜡包埋抗 Lp-PLA2 免疫组织化学（IHC）染色。实验期间每天观察小鼠生理状况，如有意外死亡小鼠尽快解剖分析其死亡原因与 AS 的关系。

1.2.3 血脂及炎症因子水平分析 血标本离心分离血清，胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、同型半胱氨酸（HCY）、Lp-PLA2 使用全自动生化分析仪检测。抗小鼠 C 反应蛋白（CRP）以及抗小鼠白细胞介素-6（IL-6）使用酶标仪检测。分析各项标志物随 AS 进程的变化趋势并比较同一时间段实验组与对照组的差异。

1.2.4 IHC 染色 自第27 周起每周选取 3 只实验组小鼠、每隔 3 周选取 3 只对照组小鼠，取血并断颈处死，取主动脉，做石蜡切片兔抗小鼠Lp-PLA2 单克隆抗体免疫组化染色，3% 过氧化氢溶液阻断内生过氧化氢酶，5% ～ 10% 山羊血清封闭，抗体稀释度为 1:50，二氨基联苯胺（DAB）显色，镜下观察 Lp-PLA2 在血管组织中的分布，探究 AS 不同时期 Lp-PLA2 在组织中的作用。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 19.0 软件统计分析，计量资料采用单样本的 K-S 检验分别进行正态性检验，符合正态性检验的计量资料采用±s的形式进行描述。组间资料比较采用独立样本t检验，生物标志物与 AS 的相关性采用多重线性回归分析评价。所有检验以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。生物标志物随时间变化曲线图采用 GraphPad Prism 5 软件绘制。

2 结果

2.1 AS 模型的建立

实验组小鼠共 45 只，饲养第4 周、第14 周、第24 周各出现 1 只小鼠死亡，可见外伤，大中动脉未见明显栓塞；主动脉 HE 染色镜下可见血管内皮下脂质核初步形成（24 周），但未见明显的纤维帽形成，由此判断死亡原因可能由同笼斗殴造成，与 AS 无关。

利用实验组小鼠做 HE 主动脉染色观测 AS斑块形成情况。实验组小鼠在第20 周龄时观测到血管内皮组织下泡沫细胞形成；26 周龄时可见脂质核形成，AS 模型建立成功[4]；30 周龄时白细胞继续聚集、脂质持续堆积、纤维帽形成；36 周龄时纤维帽明显变薄。实验组各时期 HE 染色镜下观察结果如图 1。

2.2 血清学检测

各项生物标志物随实验组小鼠周龄的变化如图 2，可见 Lp-PLA2 随时间变化呈上升趋势，其余生物标志物随时间变化趋势不明显。

2.2.1 实验组及对照组的比较 选取与对照组同期的 10 组实验组小鼠数据，比较两组小鼠各生物标志物的水平（表 1）。各项指标均成正态分布，独立样本t检验显示实验组 Lp-PLA2 水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜ 0.05），而其余指标均无统计学差异（P〉 0.05），提示在各项生物标志物中，Lp-PLA2 随 AS 进展变化更明显。

2.2.2 回归分析 简单线性回归分析显示Lp-PLA2 与周龄相关（P＜ 0.001），体重及其他生物标志物与周龄不成线性关系（P〉 0.05）。Lp-PLA2的回归方程为 Y = 99.763x + 313.155（r2= 0.937），与周龄即 AS 进程相关性较好。以周龄为应变量（Y），体重、CHO、TG、HCY、Lp-PLA2、CRP 以及 IL-6 为自变量（xi），用逐步法进行多重线性回归分析，剔除了体重、CHO、HCY、CRP 及 IL-6 等自变量，得出方程 Y = 0.011xLp-PLA2– 2.214xTG–2.147（r2= 0.989，P＜ 0.001），拟合程度较高，但共线性诊断结果显示 Lp-PLA2 存在共线性，因此采用岭回归分析。取 k = 0.26 时的回归系数，得出方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG（r2=0.89658）。

图1 HE 染色镜下实验组小鼠各时期 AS 斑块形态（× 40）（A：20 周龄时为 AS 早期，可见白细胞进入到血管内皮下，形成泡沫细胞；B：26 周龄时血管皮下脂质堆积，脂质核初步形成；C：30 周龄时脂质核扩大、纤维帽形成；D：36 周龄时脂质核进一步扩大，纤维帽明显变薄，血管腔隙变小）Figure 1 The atherosclerosis plaque morphology of experimental mice in different stages microscopically, HE staining (× 40) (A:20 week-phase, early atherosclerosis, the leukocyte enter the vascular endothelium, turn into foam cells; B: 26 week-phase, the accumulation of lipid under the vascular endothelium, the lipid nucleus was initially formed; C: 30 week-phase, the lipid nucleus expanded, the fiber cap formed; D: 36 week-phase, the lipid nucleus further expanded, the fiber cap turn thin, the vascular cavity is smaller)

图2 实验组生物标志物随时间变化曲线图Figure 2 The biomarkers of the experimental group changed over time

表1 对照组及实验组各生物标志物的比较（± s ）Table 1 Comparison of biomarkers in control group and experimental group (± s )

表1 对照组及实验组各生物标志物的比较（± s ）Table 1 Comparison of biomarkers in control group and experimental group (± s )

变量 Variable 对照组（n = 10） Control group (n = 10) 实验组（n = 10） Experimental group (n = 10) P 值 P value体重（g） Weight (g) 32.9 ± 2.2 40.1 ± 5.8 0.26 CHO（mmol/L） 13.95 ± 2.28 21.26 ± 2.53 0.665 TG（mmol/L） 1.355 ± 0.523 1.922 ± 0.845 0.151 HCY（μmol/L） 7.4 ± 1.2 7.1 ± 1.3 0.964 Lp-PLA2（U/L） 2193 ± 93 3895 ± 339 ＜ 0.05 CRP（μg/ml） 14.808 ± 2.431 15.298 ± 2.688 0.706 IL-6（pg/ml） 21.840 ± 22.917 64.345 ± 158.766 0.091

2.3 免疫组织化学染色

小鼠主动脉做抗 Lp-PLA2 IHC 染色，抗体稀释度为 1:50。实验组小鼠 20 周龄时为AS 早期，Lp-PLA2 少量分布在近血管内皮的巨噬细胞核周（图 3）。31 周龄时为 AS 中期，DAB 着色区域较 20 周龄时明显扩大，Lp-PLA2 主要分布在血管内皮下的巨噬细胞及脂质核中心（图 4）。37 周龄时为 AS 中后期，Lp-PLA2 更多分布在变薄的纤维帽下（图 5）。喂养一般饲料的对照组小鼠，其主动脉 AS 斑块内抗 Lp-PLA2 的 DAB 着色明显比实验组较浅（图 6）。

图3 AS 早期（20 周龄实验组小鼠），Lp-PLA2 随与之结合的 LDL 进入血管内皮下，并分布在巨噬细胞内，细胞间 DAB 着色较浅（× 100）Figure 3 In the early stage of atherosclerosis (20 week-phase of experimental mice), Lp-PLA2 was combined with the LDL into the endothelium and distributed in macrophages, with a relatively shallow DAB between cells (× 100)

图4 AS 中期（31 周龄实验组小鼠）细胞间 DAB 着色加深，Lp-PLA2 主要分布在脂质核中心（× 40）Figure 4 In the middle of atherosclerosis (31 week-phase of the experimental mice), DAB staining was enhanced, and Lp-PLA2 was mainly distributed in the lipid nucleus (× 40)

图5 AS 中后期（37 周龄实验组小鼠），Lp-PLA2 主要分布在变薄的纤维帽下（× 40）Figure 5 In the middle and late stage of atherosclerosis(37 week-phase of experimental mice), Lp-PLA2 was mainly distributed under the thinning fiber cap (× 40)

图6 AS 进展中期（36 周龄对照组小鼠），纤维帽初步形成，DAB 着色较浅（× 40）Figure 6 In the middle stage of atherosclerosis (36 week-phase of control mice), the fiber cap was initially formed, and DAB was relatively light (× 40)

3 讨论

多项研究证实 ApoE 基因缺陷小鼠的 AS 病变发展同人类极其相似，是适合用于研究人体 AS研究的动物模型。Nakashima 等[5]利用高脂喂养的ApoE 基因缺陷小鼠在 5 ～ 6 周龄就被观察到单核细胞趋附，8 ～ 10 周龄时主动脉外观可见脂纹形成，在 15 ～ 20 周龄时有纤维斑块形成；Johnson 和Jackson[6]也利用其建立 AS 模型，饲养至斑块破裂自然死亡，时长为（46 ± 3）周，为 AS 模型建立提供了参考依据。本实验中的高脂喂养 ApoE 基因敲除小鼠与上述模型相比病变发展较慢，是因为第8 周龄起才开始喂养高脂饮食（购入时 6 周龄 +1 周适应期，共 7 周喂养一般饲料），且高脂饲料的配方存在一定差异。

有些学者认为 Lp-PLA2 在小鼠与人体内结合的脂蛋白不同，因而在 AS 中发挥的作用亦不同[7-8]，但在本实验中，Lp-PLA2 在小鼠模型中依旧表现出了与 AS 较好的相关性。ApoE 基因敲除小鼠无论是否高脂喂养都会自发形成严重的高脂血症和 AS 斑块，因此本实验中的“周龄”可间接反映 AS 的进展情况，而对照组可看作是 AS 进展程度较低的小鼠。统计结果显示，实验组小鼠Lp-PLA2 显著高于对照组，提示随 AS 进展Lp-PLA2 升高明显，临床监测到此指标的明显升高可提示 AS 病变的生成。简单线性回归分析显示Lp-PLA2 与周龄呈显著的线性相关，而其余指标都不与周龄呈线性关系，提示 Lp-PLA2 与AS 的相关性要优于其他指标，临床检测 Lp-PLA2 有助于对患者 AS 进展情况的把握。

进行多重线性回归时体重、CHO、HCY、CRP及 IL-6 的P〉 0.05，回归系数可能为零，不具有统计学意义，因此仅以 Lp-PLA2 及 TG 为自变量得出方程。但 TG 回归系数为负数，不符合临床常理，共线性诊断显示 Lp-PLA2 的方差膨胀因子（variance inflation factor，VIF）值大于 10，存在共线性，改做岭回归分析[9]。分析结果显示 k 值在0.2 ～ 0.3 时，方程基本稳定。自 k = 0.26 起，TG 的回归系数大于 0 符合常理，取此时的回归系数，得出方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG（r2=0.89658）。

可利用以周龄即 AS 进程为 Y，Lp-PLA2 及TG 为 xi得出的方程准确判断 AS 病变的进展时期，以本实验建模过程为例，通过测定小鼠Lp-PLA2 及 TG 值，利用方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG计算周龄，所得结果 ＜ 19 则小鼠主动脉尚无 AS 斑块形成，20 ～ 26 则处于 AS 早期（脂质核形成），27 ～ 32 为 AS 中期（脂质核扩大、纤维帽形成），33 ～ 37 为 AS 进展中后期（脂质核进一步扩大、纤维帽变薄，有斑块破裂风险）。如果能够观测人体内斑块形成情况及相关标志物水平，建立用于人体 AS 模型的方程 Y = b1x1+ b2x2+ b3x3+ … + bnxn+ bn+1探讨其间关系，那么仅做血清学检测就可利用模型推断病情，大大简化临床诊断 AS 的过程。根据 Lp-PLA2 的生物学特性，以Lp-PLA2 作为治疗靶点，进行相关药物的研究也是今后研究的方向。

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