BSL-3实验室实验活动及意外事故对室内环境生物污染的定量分析

靳爱军，胡凌飞，张柯，杜涛，刘波波，李劲松，李娜

近年来，由于新发再发传染病如 SARS、甲型H1N1 流感、结核、埃博拉等高致病性空气传播传染病的暴发[1-3]，相关的实验活动日益频繁，实验室安全风险也极大增加。生物安全三级（biosafety level 3，BSL-3）实验室是为开展与第二类病原微生物相关的实验而设计建造的，其中气溶胶的形成与传播是造成生物污染与人员感染的最主要途径[4]，对实验活动与意外事故产生的气溶胶进行定量研究是实验室生物污染风险评估的重要内容。本文对BSL-3 实验室中 6 种实验活动意外事故产生的气溶胶进行定量研究，分析造成的生物污染风险，为实验室实验活动的风险评估及相应的人员防护措施等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粘质沙雷菌（8039）为军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所保藏；大肠埃希菌（ATCC 13706）及其噬菌体 ΦX174（ATCC 13706-B1）购于 ATCC 菌种保藏中心。采用普通营养琼脂培养基（TSA）、普通营养琼脂半固体培养基和营养肉汤培养基培养。Andersen 空气微生物采样器购自青岛众瑞智能仪器有限公司；0.85% 生理盐水采样管购自友康恒业生物科技（北京）有限公司。一次性环氧乙烷灭菌培养皿（直径 90 mm，倾注普通营养琼脂培养基）。

1.2 方法

本研究模拟的实验操作均在正常运行的BSL-3 实验室的生物安全柜外进行，实验过程保持温度 26 ℃，湿度 76%，压力 –93 Pa。每次实验操作之前首先使用 Andersen 二级空气微生物采样器对环境本底进行采样，作为空白对照，以确定环境中是否存在替代微生物。

实验中粘质沙雷菌的浓度为 4.68 × 109CFU/ml和 4.68 × 107CFU/ml，噬菌体 ΦX174 的浓度为1.32 × 108PFU/ml 和 1.32 × 107PFU/ml。表面采样使用无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水在采样表面均匀涂抹 5 cm × 5 cm 的方形区域 5 次[5]，将采样后的拭子放入生理盐水管中，充分混匀振荡使采集到的微生物充分释放。吸取 1 ml 的采样液直接滴加至平皿中充分混匀，然后对采样平皿进行培养。每平方厘米的微生物数为 M = N·F·D/A，其中 N 为平皿培养之后的菌落数（或噬菌斑数）；F 为采样管内液体总体积；D 为稀释倍数；A 为采样涂抹面积。每次实验后喷洒 75% 的酒精溶液和紫外灯彻底消毒灭菌。

1.2.1 吹吸混匀产生气溶胶 将 1 ml 替代微生物培养液置于 2 ml 离心管中，1 名操作人员使用移液枪反复吹吸混匀，操作 15 min。5 min 时使用Andersen 六级采样器和沉降平皿分别进行采样。采样布置如图 1A 所示。以实验过程中移液枪和离心管的位置为圆心摆放 3 个六级采样器，半径为0.2 m，采样时间 10 min。在相同的圆周的上半圆均匀摆放 6 个沉降平皿，沉降 20 min。结束后在操作区表面半径 0.2 m 的圆内选取三个点进行表面采样。更换不同浓度的微生物培养液重复上述操作。

图1 6 种实验操作及意外事故产生气溶胶的采样示意图（A：吹吸混匀；B：离心时离心管破裂；C：超声裂解；D：培养瓶意外跌落；E：冻干粉意外洒落；F：注射攻毒实验动物时意外喷出）Figure 1 Diagrammatic sketches of aerosols sampling in 6 kinds of experiments and accidents (A: Mix-up; B: Centrifugation with broken tubes; C: Ultrasonic cleavage; D: Accidental fall-off of culture flask; E: Accidental spattering of lyophilized powder; F:Accidental gush of liquid from the syringe)

1.2.2 离心时离心管破裂产生气溶胶 将 15 ml粘质沙雷菌液装入 50 ml 离心管中，将离心管塑料盖中央剪开一直径 3 mm 的孔，模拟离心时离心管破裂的意外事故，放入离心机中在温度 4 ℃、转速12000 r/min 的条件下离心 10 min。采样布置如图1B 所示。离心机周围放置 3 个 Andersen 六级采样器，离心开始同步进行采样，离心结束打开保护罩之后继续采样 5 min。离心机周围摆放 6 个沉降平皿，沉降 20 min。气溶胶采样结束后在离心机周围选取 3 个位置进行表面采样。更换不同浓度的微生物培养液重复上述操作。

1.2.3 超声裂解产生气溶胶 浓度为 4.68 ×109CFU/ml 的粘质沙雷菌液装在 2 ml 离心管中超声裂解 5 min。采样布置如图 1C 所示。在超声破碎仪腔室正对位置对称摆放 2 个 Andersen 六级采样器和 4 个沉降平皿，超声裂解的同时开启进行采样，Andersen 采样时间 5 min，沉降 20 min。完成超声裂解后在操作区台面选取 3 个位置进行表面采样。更换不同浓度的微生物培养液重复上述操作。

1.2.4 培养瓶意外跌落产生气溶胶 将微生物培养液 30 ml 装入三角瓶中，从实验人员手中意外跌落。采样布置如图 1D 所示。距离跌落点 1 m 的圆周上均匀摆放 3 个 Andersen 六级采样器，采样时间 10 min。四周摆放 13 个沉降平皿，沉降20 min。更换不同浓度的微生物培养液重复上述操作。

1.2.5 冻干粉意外洒落产生气溶胶 将替代微生物培养液冷冻干燥制成粉末分装于小三角瓶内，每个装 0.4 g，从操作者手中掉落到地板上，粉末洒出。采样布置如图 1E 所示。距离洒落点 1 m的圆周上均匀放置 3 个六级采样器，采样时间5 min。同时在洒落点周围摆放 13 个沉降平皿，沉降 20 min。更换冻干粉重复上述操作。

1.2.6 注射攻毒实验动物时意外喷出产生气溶胶 注射器中吸取 0.2 ml 微生物培养液，模拟攻毒液从注射器中喷出到环境中的意外事故。采样布置如图 1F 所示。在距离操作点 0.1 m 处均匀放置3 个 Andersen 六级采样器，同时开始采样，采样时间 5 min。在四周摆放 6 个沉降平皿，沉降20 min。更换不同浓度的微生物培养液重复上述操作。

1.3 替代微生物采样平皿的培养与气溶胶浓度的计算

粘质沙雷菌采样平皿 30 ℃ 恒温培养 24 h，计数每个平皿的菌落数。噬菌体 ΦX174 采样平皿倒上层后 37 ℃ 恒温培养 24 h，计数每个平皿的噬菌斑数。

Andersen 六级采样器的采样流量为 28.3 L/min，采样平皿按照文献[6]校正后的菌落数（或嗜菌斑数）及采样流量计算空气中的微生物气溶胶浓度。

微生物气溶胶浓度[7]：C = 5000·N/(A·t)，式中C 为微生物气溶胶浓度（CFU/m3或 PFU/m3）；N 为沉降平皿上生长的菌落数（或噬菌斑数）；A 为平皿面积（cm2）；t 为采样时间（min）。

2 结果

2.1 吹吸混匀产生气溶胶

吹吸混匀过程产生的气溶胶浓度见表 1 和表 2，Andersen 采样器②采集到的微生物气溶胶浓度最高，说明实验人员操作过程中，在其正面产生的气溶胶浓度最高。对操作区表面采样的结果均为 0。

2.2 离心时离心管破裂产生气溶胶

离心管破裂条件下进行离心时，产生的气溶胶浓度见表 3 和表 4，微生物气溶胶的最高检测浓度为 16 CFU/m3。对操作区表面采样的结果均为 0。

2.3 超声裂解产生气溶胶

超声裂解时产生的气溶胶浓度见表 5，采样的最高气溶胶浓度为 92 CFU/m3。对操作区表面采样的结果为 0。

表1 吹吸混匀产生气溶胶浓度-Andersen 采样结果Table 1 Concentrations of aerosols generated in the process of mix-up-results of the Andersen sampling

表2 吹吸混匀产生气溶胶浓度-沉降法采样结果Table 2 Concentrations of aerosols generated in the process of mix-up - results of the settling sampling

表3 离心时离心管破裂产生气溶胶浓度-Andersen 采样结果Table 3 Concentrations of aerosols generated in the process of centrifugation with broken tubes - results of the Andersen sampling

表4 离心时离心管破裂产生气溶胶浓度-沉降法采样结果Table 4 Concentrations of aerosols generated in the process of centrifugation with broken tubes - results of the settling sampling

表5 超声裂解产生气溶胶浓度Table 5 Concentrations of aerosols generated in the process of ultrasonic cleavage

2.4 培养瓶意外跌落产生气溶胶

培养瓶意外跌落产生的气溶胶浓度见表 6 和表 7，采样最高值为 1576 CFU/m3。且 Andersen 与沉降法采样结果的分布一致。

2.5 冻干粉意外洒落产生气溶胶

替代微生物冻干粉意外洒落产生的气溶胶浓度见表 8 和表 9，采样最高值为 1618 PFU/m3。与 2.4 所示结果相反，噬菌体 ΦX174 冻干粉产生的气溶胶浓度远高于粘质沙雷菌冻干粉意外洒落的结果，这可能是冻干粉中微生物含量不一致的影响。

2.6 注射攻毒实验动物时意外喷出产生气溶胶

注射时意外喷出至环境中产生的气溶胶浓度见表 10 和表 11，采样最高值达 27336 CFU/m3。

表6 培养瓶意外跌落产生气溶胶浓度-Andersen 采样结果Table 6 Concentrations of aerosols generated when the culture flask fell off accidently-results of the Andersen sampling

表7 培养瓶意外跌落产生气溶胶浓度-沉降法采样结果Table 7 Concentrations of aerosols generated when the culture flask fell off accidently-results of the settling sampling

表8 冻干粉意外洒落产生气溶胶浓度-Andersen 采样结果Table 8 Concentrations of aerosols generated when the lyophilized powder spattered accidently-results of the Andersen sampling

表9 冻干粉意外洒落产生气溶胶浓度-沉降法采样结果Table 9 Concentrations of aerosols generated when the lyophilized powder spattered accidently-results of the settling sampling

表10 注射攻毒实验动物时意外喷出产生气溶胶浓度-Andersen 采样结果Table 10 Concentrations of aerosols generated during the accidental gush of liquids from syringe-results of the Andersen sampling

表11 注射攻毒实验动物时意外喷出产生气溶胶浓度-沉降法采样结果Table 11 Concentrations of aerosols generated during the accidental gush of liquids from syringe-results of the settling sampling

3 讨论

实验室中的各种实验活动和意外事故均会产生不同浓度的微生物气溶胶，根据参考文献[8-10]，产生的气溶胶浓度注射攻毒时意外喷出约104CFU/m3，培养瓶意外坠落和冻干粉意外洒落约103CFU/m3（PFU/m3），吹吸混匀、离心时离心管破裂及超声裂解均为 10 ～ 100 CFU/m3（PFU/m3）。本文在 BSL-3 实验室中的研究结果与之一致，说明 BSL-3 实验室中各种实验活动和意外事故时产生的微生物气溶胶不能忽视。

不同实验活动产生不同浓度的微生物气溶胶，并且产生的气溶胶粒子大小也不同。据 Kenny 和Sabel[11]的研究，冻干粉意外洒落产生气溶胶的粒径大于 5 μm，其他实验活动的粒径则小于 5 μm。实验结果显示吹吸混匀、离心时离心管破裂及超声裂解产生的气溶胶浓度较低，但其粒径小于 5 μm，会在空气中长时间悬浮，并且一旦被吸入到达人体肺深部的概率更大，因此对环境的污染及人员感染的风险不可小觑。气溶胶粒子粒径越小，其沉降速度越慢，使用沉降平皿采集到的粒子数较 Andersen空气采样的结果少，这与本文所述的实验结果一致。

环境湿度对气溶胶粒子的影响也很显著。当环境比较干燥时，气溶胶粒子携带的水分蒸发较快，从而使粒子变小，更易长时间悬浮于空气中，不易沉降；而当环境湿度较高时，气溶胶粒子作为凝结核易于吸收更多水分变大甚至发生团聚，从而沉降速度加快。BSL-3 实验室具有独立的通风循环系统，微生物气溶胶会随着气流在实验室内漂浮，实验人员活动也会影响实验室内的气流，降低气溶胶粒子沉降速度，增加感染的风险。

综上，在 BSL-3 实验室内进行实验活动时，微生物气溶胶的感染风险需要引起高度重视，做好个人防护，对呼吸道防护装备的使用应测试面型密合度，以最大程度地降低或消除实验活动及意外事故引起的人员感染。

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