两种过氧化氢蒸汽发生器在生物安全三级实验室中的应用比较

冯小丽，李明华，韩建保，王洪波，郑永唐

生物安全实验室是指通过规范的实验室设计建造、实验设备的配置、个人防护装备的使用，严格遵从标准化的工作操作程序和管理程序等，可以保证工作人员、周围环境和实验因子安全的实验室[1-2]。按照防护等级的不同，生物安全实验室分为1 ～ 4 级；高等级生物安全实验室包括生物安全防护等级为三级和四级的实验室[2]。

生物安全实验室的核心是“安全”，因此采取安全、有效的消毒灭菌措施是实验室生物安全的重要保障，贯穿整个实验过程直至实验结束。目前生物安全实验室常用的空气消毒方法主要有紫外线照射、化学消毒剂熏蒸等[3]。因紫外线照射需要直接照射被消毒物体表面或空气才起作用，而对被遮挡的墙壁表面、地面和工作台面等则不起作用，所以高等级生物安全实验室基本采用气体熏蒸消毒方法[4]。常规用的熏蒸消毒剂，包括甲醛（HCHO）、二氧化氯（ClO2）等因其副作用或损坏性明显，近年来部分高等级生物安全实验室开始采用汽化过氧化氢（hydrogen peroxide vapor，HPV）进行消毒灭菌[5-6]。

HPV 作为一种新型气体消毒灭菌技术，已广泛应用于生物制药工厂、医疗卫生、生物实验室等诸多领域。本文旨在观察两种过氧化氢蒸汽发生器（BIOQUELL Z-2 和 BIOQUELL L-2）分别对生物安全三级实验室的房间及传递窗的消毒灭菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备 BIOQUELL Z-2 和 BIOQUELL L-2过氧化氢蒸汽发生器购自英国 Bioquell 公司，其中 BIOQUELL Z-2 型过氧化氢蒸汽发生器系统主要由主设备和控制台组成，适用于空间的消毒灭菌。灭菌前，将主设备推进待灭菌房间，控制台放置在辅助区，电缆经待灭菌房间与辅助区之间的消毒专用穿墙孔将主设备与控制台连接。BIOQUELL L-2 型过氧化氢蒸汽发生器是通过设备上两根管道分别与待灭菌设备的消毒接口连接，形成一个闭合回路，然后进行消毒灭菌，主要适用于对传递窗、高效过滤器箱体等带有消毒接口的设备进行消毒灭菌。

1.1.2 生物指示剂 嗜热脂肪芽孢试纸条，含细菌芽孢数 2.8 × 106个/片，为蓝色薄玻璃纸封套单条包装，购自美国 Mesalabs 公司。

图1 密闭房间内生物指示剂布点图Figure 1 Layout of biological indicator in the enclosed room

1.1.3 培养基 PM/100 Releast 培养基（含特殊配方的大豆酪蛋白降解物和颜色指示剂，24 h 内可观察得到结果）购自美国 Mesalabs 公司。

1.1.4 消毒剂 30% 分析纯过氧化氢溶液购自天津化学试剂三厂。

1.2 方法

1.2.1 房间灭菌效果验证

1.2.1.1 房间灭菌条件优化 为了确定最佳的过氧化氢空间分布量，首先选择在一间 120 m3的密闭实验室内进行条件优化。①生物指示剂布点：将嗜热脂肪芽孢试纸条分别放置在房间的各个顶角、底角、生物安全柜操作台下及高效过滤器下游等比较难灭菌的位置（具体布点详见图 1）。②消毒灭菌处理：将 BIOQUELL Z-2 过氧化氢蒸汽发生器主机放置在实验室中间位置，控制台放置在辅助区。分别按 5、8、10、15 g/m3的过氧化氢空间分布浓度设定好程序，然后启动灭菌程序，待一个灭菌程序完成后，立即开启系统排风。③灭菌效果监测：先用手持式过氧化氢探测仪探测房间内的过氧化氢浓度，待过氧化氢降到 1 ppm 安全浓度以内时，进入房间取出嗜热脂肪芽孢试纸条接种到Releast 培养基（事先加入 5% 硫代硫酸钠中和剂）中，将未灭菌的嗜热脂肪芽孢试纸条接种到同批培养基中作为阳性对照，将未加生物指示剂的同批培养基作为阴性对照，同时置于 57 ℃ 恒温培养箱中培养 24 h。每组试验至少重复 3 次。

1.2.1.2 不同体积的房间灭菌效果验证 分别对体积为 120、28、109、52、65 m3的 5 间密闭实验室进行灭菌效果验证，按 1.2.1.1 中确定的过氧化氢空间分布量设定灭菌程序，灭菌过程同上。每个房间至少重复试验 3 次。

1.2.2 传递窗灭菌效果验证 同房间一样，首先确定了最佳的过氧化氢用量。本实验室的传递窗体积为 1 m3左右。①生物指示剂布点：在传递窗的前后、上下角分别布置 1 个嗜热脂肪芽孢试纸条（具体布点详见图 2）。②消毒灭菌处理：将BIOQUELL L-2 过氧化氢蒸汽发生器上的供给管和回流管分别与传递窗侧面的 2 个消毒专用接口（进气口和回流口）连接好。分别按 15、20、25、30 g 的过氧化氢总量设定程序，启动灭菌程序，待一个灭菌程序完成后，立即开启排风。③灭菌效果监测同 1.2.1.1。每组试验至少重复 3 次。

图2 传递窗内生物指示剂布点图Figure 2 Layout of biological indicator in the pass-through box

2 结果

2.1 房间灭菌条件优化结果

经 3 次重复试验验证，当过氧化氢空间分布量为 10 g/m3及以上时可以将放置在受测房间不同位置的嗜热脂肪芽孢载体完全杀灭（表 1）。

2.2 不同体积房间灭菌验证结果

用 BIOQUELL Z-2 过氧化氢蒸汽发生器分别对 5 间不同体积的密闭房间进行灭菌验证，3 次重复试验结果表明采用 10 g/m3的过氧化氢空间分布量可以将放置在房间内不同位置的嗜热脂肪芽孢载体完全杀灭（表 2）。

2.3 传递窗灭菌验证结果

用 BIOQUELL L-2 过氧化氢蒸汽发生器对传递窗进行灭菌验证，经 3 次重复试验，结果表明当过氧化氢用量达到 25 g 及以上时可以将放置在传递窗内不同位置的嗜热脂肪芽孢载体完全杀灭（表 3）。

表1 不同过氧化氢空间分布量对密闭房间的灭菌效果Table 1 The sterilization efficacy of different hydrogen peroxide dosage on the enclosed room

表2 过氧化氢对不同体积密闭房间的灭菌效果Table 2 The sterilization efficacy of hydrogen peroxide on the enclosed rooms with different volume

表3 不同过氧化氢剂量对传递窗的灭菌效果Table 3 The sterilization efficacy of different hydrogen peroxide dosage in the pass-through box

3 讨论

生物安全三级实验室是从事高致病性病原微生物研究的场所，在这种场所内操作容易引起病原微生物的暴露性感染，导致感染事故发生。此外，危险物质的不正规操作、实验室关键设施设备的故障及废弃物的不当处理都可能对环境产生风险[7]。采取有效的消毒灭菌方法是预防生物安全实验室感染及保障实验活动顺利开展的有效措施。HPV 技术是一种新型气体消毒技术，自从 20 世纪 80 年代推出以来，已广泛用于隔离器、空气过滤器、传染病病房等生物安全消毒领域[5]。目前市面上的过氧化氢蒸汽发生器多数都由英国 Bioquell和美国 Steris 公司生产[8]。本实验室引进了英国Bioquell 的 BIOQUELL Z-2 和 BIOQUELL L-2两种过氧化氢蒸汽发生器分别用于房间和传递窗的消毒灭菌。

BIOQUELL 过氧化氢蒸汽发生器的主要原理是通过“闪蒸”的方式将液态过氧化氢转化为气态过氧化氢，然后 HPV 被均匀地引入密闭空间，并在消毒空间内表面形成 2 ～ 6 μm 的过氧化氢膜，附着在可能寄居微生物的表面，微生物自身会作为核心被形成的微冷凝所包裹，并迅速被此过程杀灭[9-10]。该消毒过程可在常温常湿的环境下有效进行，不需要进行除湿等特别的预处理。相较于传统的消毒过程具有快速、安全、无残留等特点。此外，HPV 相比其他消毒剂（如二氧化氯、甲醛等）具有广泛的材料适应性，有研究报道 HPV 对各种金属材料、建筑物、精密仪器等都没有影响[11-12]。

国内有关 HPV 在生物安全实验室的相关应用报道很多[6,13]，本研究结果也证明，当 BIOQUELL Z-2 过氧化氢蒸汽发生器用于房间消毒灭菌时，采用 10 g/m3的过氧化氢空间分布量可以将放置在不同体积密闭房间内不同位置的嗜热脂肪芽孢载体完全杀灭。当 BIOQUELL L-2 过氧化氢蒸汽发生器用于传递窗消毒灭菌时，用 25 g 过氧化氢可以将放置在传递窗不同位置的嗜热脂肪芽孢载体完全杀灭。本实验室需要消毒灭菌的设备主要包括空间（房间、通风系统等）和关键防护设备（传递窗、隔离器、高效过滤器箱体等），下一步会继续用 HPV 对这些设施设备进行消毒验证。

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