TLR4/NF—κB信号通路在切口痛作用机制中的实验研究

刘德华 王建 高志强 邹连生 徐鹰

[摘要] 目的 探討脊髓Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号通路在切口痛大鼠中的作用机制。 方法 选取20周龄的SD健康成年雄性SPF级大鼠100只，建立大鼠切口痛模型，于术前和术后0.5 h、1 h、2 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d，采用电子von Frey压力测痛仪检测大鼠非术侧和术侧的机械缩足反应阈值（MWT）；于术前和术后2 h、8 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测脊髓TLR4、NF-κB、白介素1β、（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平。 结果 术后，大鼠术侧的MWT较术前降低，术后2 h时最低，之后逐渐升高，且显著低于非术侧（P < 0.05）。术后，大鼠脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表达水平较术前升高，且术后2 h、8 h、1 d、2 d和3 d与术前比较差异有统计学意义（P < 0.05），术后5 d和7 d与术前比较差异无统计学意义（P > 0.05），术后1 d脊髓TLR4、NF-κB表达水平达到最高，术后8 h脊髓IL-1β、TNF-α表达水平达到最高。采用Pearson相关性分析结果显示，大鼠术侧MWT与TLR4和NF-κB表达水平呈负相关（r = -0.473，P < 0.05；r = -0.398，P < 0.05），大鼠脊髓TLR4与IL-1β和TNF-α表达水平呈正相关（r = 0.302，P < 0.05；r = 0.538，P < 0.05）；大鼠脊髓NF-κB与IL-1β和TNF-α表达水平呈正相关（r = 0.283，P < 0.05；r = 0.467，P < 0.05）。 结论 切口痛大鼠脊髓TLR4/NF-κB信号通路被激活，TLR4、NF-κB表达水平升高，并上调下游炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平，参与切口痛的调控过程。

[关键词] Toll样受体4；核因子κB；切口痛；大鼠

[中图分类号] R619.6R [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（a）-0023-04

Experimental study of TLR4/NF-κB signal pathway in the mechanism of incisional pain

LIU Dehua1 WANG Jian2 GAO Zhiqiang1 ZOU Liansheng1 XU Ying3

1.Deaprtment of Neurosurgery， First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China； 2.Department of Pathology， Ganzhou People′s Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China； 3.Scientific Research Center， Gannan Medical University， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Toll like receptor 4 （TLR4）/ nuclear factor κB （NF-κB） signal pathway in rats with incisional pain. Methods One hundred healthy adult male Sprague-Dawley （SD） SPF rats of 20 weeks old were selected to establish incision pain models. Before operation and after operation for 0.5 h， 1 h， 2 h， 8 h， 12 h， 1 d， 2 d， 3 d， 5 d， 7 d， the mechanism withdraw threshold （MWT） in non-operative side and operative side of rats were detected by electronic von Frey pressure pain threshold detector. Before operation and after operation for 2 h， 8 h， 1 d， 2 d， 3 d， 5 d and 7 d， the expression of TLR4， NF-κB， interleukin 1β （IL-1β） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in the spinal cord were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （real-time PCR）. Results After operation， the MWT in the operative side of rats was lower than that before operation， which was the lowest after operation for 2 h， then increased gradually， and they were significantly lower than those of non-operative side （P < 0.05）. After operation， the expression levels of TLR4， NF-κB， IL-1β and TNF-α in spinal cord of rats were increased compared with those before operation， which of postoperative 2 h， 8 h， 1 d， 2 d and 3 d had statistically significant differences compared with those before operation （P < 0.05）， which of postoperative 5 d and 7 d had no statistically significant differences compared with those before operation （P > 0.05）. The expression levels of TLR4 and NF-κB in the spinal cord reached the highest after operation for 1 d， and the expression levels of IL-1β and TNF-α reached the highest after operation for 8 h. Pearson correlation analysis showed that there was a negative correlation of MWT in operative side with the expression of TLR4 and NF-κB （r = -0.473， P < 0.05， r = -0.398； P < 0.05）， the TLR4 levels in spinal cord of rats were positively correlated with the expression levels of IL-1β and TNF-α （r = 0.302， P < 0.05； r = 0.538， P < 0.05）， and the NF-κB levels in spinal cord of rats were positively correlated with the expression levels of IL-1β and TNF-α （r = 0.283， P < 0.05； r = 0.467， P < 0.05）. Conclusion The signal pathway of TLR4/NF-κB in spinal cord of rats with incisional pain is activated， the expression levels of TLR4 and NF-κB are increased， and the expression levels of downstream inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α are up-regulated， which is involved in the regulation process of incisional pain.

[Key words] Toll like receptor 4； Nuclear factor κB； Incisional pain； Rat

术后疼痛指术后即刻发生的急性疼痛，严重影响患者的术后治疗及恢复[1]。免疫应答和炎性反应参与术后疼痛的发生和发展[2-3]。Toll样受体4（TLR4）属于Toll样受体家族，介导后天免疫和天然免疫[4]。核因子κB（NF-κB）是一种具有多向性转录激活功能的调节因子，参与调控机体炎性反应、免疫应答等多种生理过程[5]。白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）作为重要的促炎细胞因子，能够诱发炎性反应[6-7]。本研究选取大鼠切口痛模型，探讨脊髓TLR4/NF-κB信号通路在切口痛大鼠中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取20周龄的Sprague-Dawley（SD）健康成年雄性SPF级大鼠100只，体重200～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号：SCXK（京）2007-0001号]。实验前8 h禁食，自由饮水，室温（21±2）℃，湿度30%～70%，光照每昼夜12 h。实验全程严格按照国家有关实验动物的规定执行，经生物医学研究伦理委员中心批准。

1.2 实验方法

制备大鼠切口痛模型。大鼠吸入2%异氟醚麻醉，仰卧位固定，左后爪无菌消毒，在足底近端约0.5 cm处向趾部做长约1 cm的纵行手术切口，用镊子挑起足底肌肉并做纵向切割，保持肌肉完整的起止和附着点，按压止血，用5-0尼龙线缝合皮肤，手术切口处给予碘伏消毒并覆盖抗生素软膏，模型制备完成。大鼠切口痛模型制备成功表现为术后大鼠舔咬术侧后足，术侧后足不愿着地，且无运动障碍等现象。

1.3 观察指标

1.3.1 测定机械缩足反应阈值（MWT） 随机选取10只大鼠分别于术前0 h和术后0.5 h、1 h、2 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d，采用电子von Frey压力测痛仪（美国IITC公司）检测大鼠非术侧、术侧的MWT。在安静状态下，以持续增压的方式触压大鼠第3、4趾间的皮肤，当大鼠激现快速甩足、迅速缩回等反应时，停止加压，读取测痛仪压力数值，即为MWT，测量3次，取平均值。

1.3.2 脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表达水平 分别于术前和术后2 h、8 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d各取10只大鼠，处死后取脊髓组织L4～L6段，采用Trizol（美国Invitrogen公司）抽提RNA，采用实时荧光定量PCR法检测脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表达水平。TLR4引物：5′-GCCTTTTCCAA？鄄AGCTGAGTC-3′，5′-TGACACCATTGAAGCTGAGG-3′，长度200 bp；NF-κB引物：5′-CAAGATCTGCCGA？鄄GTAAACC-3′，5′-TCGGAACACAATGGCCACTT-3′，长度180 bp；IL-1β引物：5′-CCGACCTCATTTTCTTC？鄄TGG-3′，5′-ATGCCATGCGAGTGACTTAG-3′，长度250 bp；TNF-α引物：5′-TGATCCGAGATGTGGAACTG-3′，5′-TTGGGAACTTCTCCTCCTTG-3′，长度180 bp；内参GAPTH引物：5′-TCAAGGCTGAGAATGGGAA？鄄G-3′，5′-CGGAGATGATGACCCTTTTG-3′，长度190 bp；PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循环；72℃延伸10 min。采用2-△△Ct法[8]计算目的基因的相对表达水平。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 20.0软件分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Pearson相关检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非术侧和术侧切口痛大鼠各时点MWT比较

术前，切口痛大鼠非术侧和术侧MWT比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。非术侧MWT手术前后比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。术后，術侧MWT均较术前显著降低，术后2 h时最低，之后逐渐升高，且显著低于非术侧，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 各时间点切口痛大鼠脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的相对表达水平比较

术后，切口痛大鼠脊髓TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表达水平较术前升高，且术后2 h、8 h、1 d、2 d和3 d与术前比较差异有统计学意义（P < 0.05），术后5 d和7 d与术前比较差异无统计学意义（P > 0.05），术后1 d脊髓TLR4、NF-κB表达水平达到最高，术后8 h脊髓IL-1β、TNF-α表达水平达到最高。见表2。

2.3 切口痛大鼠MWT与脊髓TLR4和NF-κB表达水平的相关性

采用Pearson相关性分析结果显示，大鼠术侧MWT与TLR4和NF-κB表达水平呈负相关（r = -0.473，P < 0.05；r = -0.398，P < 0.05）。

2.4 切口痛大鼠脊髓TLR4和NF-κB与IL-1β和TNF-α表达水平的相关性

采用Pearson相关性分析结果显示，大鼠脊髓TLR4与IL-1β和TNF-α表达水平呈正相关（r = 0.302，P < 0.05；r = 0.538，P < 0.05）；大鼠脊髓NF-κB与IL-1β和TNF-α表达水平呈正相关（r = 0.283，P < 0.05；r = 0.467，P < 0.05）。

3 讨论

术后疼痛是机体受到手术刺激后的一系列反应，严重影响患者的生活质量[9]。因此，术后疼痛的治疗手段是目前研究的热点。术后创伤组织和炎性细胞释放炎性介质，如IL-1、TNF-α等，导致炎性反应，进而引起疼痛[10-11]。IL-1、IL-6、TNF-α等炎性介质能够诱导初级传入神经分泌iNOS、COX-2等疼痛介质，传入中枢，导致中枢敏化，出现自发性疼痛、疼痛延时等症状[12]。

研究指出大鼠切口痛模型在术后0.5 h术侧后爪表现明显的痛觉过敏，2 h达到峰值，且可持续到术后4～7 d[13]。由于大鼠切口痛模型的行为学反应和临床术后疼痛相似，因此，其在许多研究中已经被广泛使用。本研究结果显示，术侧的MWT较术前降低，术后2 h时最低，之后逐渐升高，且低于非术侧。说明本研究建立大鼠切口痛模型成功，该模型具有重复性和稳定性。

TLR4主要表达于中枢神经系统的胶质细胞，胶质细胞在术后疼痛的发生发展中发挥重要作用[14]。在切口损伤等刺激作用下，中枢免疫细胞被激活，分泌大量和疼痛相关的因子，如IL-1、TNF-α等，形成炎症级联反应，参与脊髓水平的信号传导，引起痛觉过敏[15]。当神经系统受到损伤时，在损伤神经处NF-κB信号转导通路及其下游介质被激活，引起炎性反应，进而参与疼痛的发生和发展[16-18]。本研究结果显示，术后，大鼠脊髓TLR4、NF-κB的表达水平升高，并且术后1 d脊髓TLR4、NF-κB表达水平达到最高。结合大鼠术侧MWT的变化趋势，Pearson相关性分析结果显示，大鼠术侧MWT与TLR4和NF-κB表达水平呈负相关性。说明大鼠切口痛可以激活TLR4/NF-κB信号转导通路的上游因子TLR4和NF-κB。

为了验证整个TLR4/NF-κB信号转导通路是否激活，本研究检测TLR4/NF-κB信号转导通路下游炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的表达水平。IL-1β一方面能够引起疼痛调制因子（缓激肽、NO等）的升高，另一方面能够引起神经生长因子的升高，诱发痛觉过敏[19-21]。TNF-α一方面能够直接作用于中枢感受器，造成中枢过敏，另一方面能够诱导合成前列腺素E2，释放儿茶酚、缓激肽，诱导痛觉过敏[22-24]。本研究结果显示，术后，大鼠脊髓IL-1β、TNF-α的表达水平升高，并且术后8 h脊髓IL-1β、TNF-α表达水平达到最高。说明大鼠切口痛模型中TLR4/NF-κB信号转导通路下游信号因子IL-1β、TNF-α也被激活。且IL-1β、TNF-α表达水平达到最高的时间均早于TLR4、 NF-κB。Pearson相关性分析结果显示，大鼠脊髓TLR4与IL-1β和TNF-α表达水平呈正相关；大鼠脊髓NF-κB与IL-1β和TNF-α表达水平呈正相关。提示IL-1β、TNF-α表达水平升高一方面是TLR4/NF-κB信号通路激活，另一方面可能存在其他通路的激活。

综上所述，切口痛大鼠脊髓TLR4/NF-κB信号通路被激活，TLR4、NF-κB表达水平升高，进而上调下游炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平，诱发炎性反应，参与切口痛的调控过程。

[参考文献]

[1] 朱红，魏丽丽，胡晓晓，等.网络信息化术后疼痛管理有效性研究[J].中国实用护理杂志，2016，32（29）：2307-2310.

[2] 兰岭，黄宇光，申乐.术后慢性疼痛相关炎症反应与免疫调节机制研究进展[J].中国疼痛医学杂志，2017，23（3）：161-164.

[3] 陈佳佳，童莺歌，柴玲.我国术后疼痛管理影响因素的研究进展[J].中国实用护理杂志，2017，33（19）：1514-1517.

[4] Ellis A，Grace PM，Wieseler J，et al. Morphine amplifies mechanical allodynia via TLR4 in a rat model of spinal cord injury [J]. Brain Behav Immun，2016，58：348-356.

[5] 林勇军，吴春芳，叶志荣.银杏叶滴丸对冠心病患者TLR4/NF-κB信号通路及免疫指标的影响[J].海峡药学，2017， 29（3）：89-92.

[6] Pu W，Xin Y，Guan PP，et al. Magnesium ion influx reduces neuroinflammation in Aβ precursor protein/Presenilin 1 transgenic mice by suppressing the expression of interleukin-1β [J]. Cell Mol Immunol，2017，14（5）：451-464.

[7] 王红灿，胡诗帆，莫林波，等.小鼠肥胖介导的肠道炎症反应与肠癌发病关系研究[J].科学技术与工程，2016，16（20）：30-36.

[8] 周威，汤展宏，胡军涛，等.亚低温对急性肺损伤大鼠Toll样受体2蛋白表达及下游促炎因子的影响[J].中国急救医学，2015，35（2）：161-166.

[9] 赵丽云，奚雪梅.三位一体疼痛管理模式在踝关节骨折病人术后疼痛管理中的应用[J].全科护理，2017，15（31）：3927-3930.

[10] 趙庆盼，张玉勤，郑荣芝，等.经皮神经电刺激对大鼠切口痛的镇痛效果及血浆炎症因子的影响[J].广西医科大学学报，2017，34（4）：518-521.

[11] 王云涛，单世民，刘晓智.HO-1/CO信号通路对切口痛大鼠炎症因子的调控作用[J].天津医药，2016，44（9）：1073-1077.

[12] 丁建龙，何智明，刘晓晨，等.腹腔镜胆囊切除术患者围术期疼痛介质及炎性介质的变化研究[J].河北医学，2016， 22（1）：65-68.

[13] 王雪梅，王亚平，吕志平，等.臭氧化盐水对大鼠切口痛模型行为学及血浆TNF-α、IL-6的影响[J].中国医师杂志，2016，18（4）：508-511.

[14] 吉栋，周亚兰，季锋，等.脊髓TLR4信号通路在大鼠炎性痛形成中的作用[J].中华麻醉学杂志，2017，37（5）：544-546.

[15] 胡兴国，阳红艳，文锟，等.脊髓TLR4/p38MAPK级联活化介导持续性术后痛时TNF-α的增加[J].中国疼痛医学杂志，2016，22（1）：23-27.

[16] 杨涛，杨沛，周日永，等.脊髓核因子κB抑制因子/核因子κB信号转导通路在大鼠切口痛中作用及机制的实验研究[J].中国医药，2016，11（5）：756-760.

[17] 陆贝，于源泉，殷俊杰，等.NF-κB/TLR4信號通路在急性胰腺炎大鼠肝损伤中的表达及PPAR-γ激动剂的保护作用[J].中国现代医生，2016，54（33）：30-33，封3.

[18] 吴玉泓，许雅清，李海龙，等.久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠TLR4及NF-κB p65表达的影响[J].中国实验动物学报，2016，24（1）：47-52.

[19] ？魣lvarez-Croda DM，Santiago-García J，Medel-Matus JS，et al. Hippocampal distribution of IL-1β and IL-1RI following lithium-pilocarpine-induced status epilepticus in the developing rat [J]. An Acad Bras Cienc，2016，88 Suppl 1：653-663.

[20] 柳静，陆启滨.安子合剂对抗磷脂抗体阳性流产小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响[J].中国药房，2017，28（1）：31-35.

[21] 甘邻元，周明森，刘洋.注射用鼠神经生长因子对重型颅脑损伤合并肺部感染患者血清相关炎症因子的影响研究[J].脑与神经疾病杂志，2017，25（10）：632-635.

[22] Tayman C，Aydemir S，Yakut I，et al. TNF-α Blockade Efficiently Reduced Severe Intestinal Damage in Necrotizing Enterocolitis [J]. J Invest Surg，2016，29（4）：209-217.

[23] Aoki T，Narumiya S. Prostaglandin E2-EP2 signaling as a node of chronic inflammation in the colon tumor microenvironment [J]. Inflamm Regen，2017，37：4.

[24] 向晶，陈海君，施军平.高脂高糖饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织TLR4和MyD88 mRNA的表达[J].中国现代医生，2016，54（30）：24-28.

（收稿日期：2017-10-22 本文编辑：张瑜杰）