微生物发酵对牛肉调味基料的增香作用

樊晓盼,马俪珍,2,*,张伯男,仇泓博

(1.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300384;2.天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384)

肉味香精是广泛用于肉类加工和方便食品中的一类食品调味料,通常是以肉或畜禽骨为原料经热压浸提、酶解、美拉德反应制备而成[1]。刘丹等[2]通过优化美拉德反应工艺条件制备出肉香味浑厚的兔肉香精并将其微胶囊化,拓宽了国内肉类香精的市场。刘金凯等[3]以氨基酸和还原糖为底物经美拉德反应制得肉味浓郁、香气柔和的羊肉味调味基料。吕玉等[4]模拟反应体系制备出有明显牛肉特征味的牛肉香精。然而采用酶解-美拉德反应制备生产的肉味香精往往香气不足,外观不均,通常需添加化学合成类香精和其它食品添加剂等进行调配,以满足天然肉味香料的浓厚香味,但添加化学合成类香精往往会失去这类产品天然、安全的特点[5]。由于微生物在代谢过程中能够分泌蛋白酶、脂肪酶等,可作用于大分子物质降解形成小分子产物,可为美拉德反应提供前体物质,还能够产生特殊的发酵香味,降解或消解某些异味物质,因此学者们认为将发酵技术引入传统肉味香精的制备工艺,可能会提高肉味香料的风味和安全性[6-8]。

分析食品风味通常采用的是感官评定法,人有着敏锐的嗅觉,感官评定结果更能代表市场实际需求情况,但由于不同的评定人员对气味和滋味有着不同的敏感程度,而且很容易对风味感知产生疲劳,因此会导致评定结果主观性较强[9]。电子鼻能够模拟人体嗅觉器官,将待测样品挥发出来的气体通过传感器检测得到信号图谱,从而实现气味相关化合物和挥发性化合物的快速鉴别[10]。目前电子鼻在食品领域主要用于区分原料的新鲜程度[11]、检测食品的气味变化[12-13]、预测产品的货架期[14]以及快速检测肉品掺杂掺假[15-16]等。电子舌是在仿生学基础上发展起来的一种分析、识别液体滋味成分的检测仪器,实现了对待测液体整体滋味品质进行客观分析,判别出样品之间整体味觉上的差异,具有快速、准确、客观、重复性好等特点[17-18],已经广泛应用于环境监测[19]、医药[20]、食品等领域。

本实验以冷冻牛胴体用电锯分割时所产生的牛骨肉末为原料,经热压浸提、酶解后接种不同菌种发酵一定时间后,添加氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸)、糖(木糖和葡萄糖)以及维生素VB1进行美拉德热反应得到牛肉调味基料,采用感官评价结合电子鼻和电子舌对其挥发性气味和滋味成分进行分析,目的是探讨微生物发酵技术应用于牛肉调味基料生产中的可行性,进而为实际生产中发酵剂菌种的筛选以及微生物产香机制的探索提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛骨肉末 冷冻牛胴体电锯分割时留下的肉末(骨肉比为3∶7),由天津挂月食品有限公司提供;风味蛋白酶(500 L APU/g)、复合蛋白酶(1.5AU/g) 丹麦诺维信公司;萨科WBL-45(肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌+清酒乳杆菌)、萨科WBX-43(肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌)、萨科BOM-13(清酒乳杆菌)和萨科THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌) 意大利萨科公司;优级氯化钠 国产分析纯,天津市盛淼科技有限公司;L-半胱氨酸、丙氨酸 冀州市华阳华工有限责任公司;甘氨酸 冀州华恒生物科技有限公司;VB1江西天新药业有限公司;葡萄糖、木糖 山东西王糖业有限公司。

Astree电子舌 法国AlphaM.O.S公司;PEN3电子鼻 德国AIRSENSE公司;SX-500高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY有限公司;THZ-98AB型恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;Friocell 22恒温恒湿培养箱 艾力特国际贸易有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备工艺

1.2.1.1 热压浸提 称取牛骨肉末,按照骨肉末和水质量比为1∶4添加蒸馏水,用玻璃棒搅拌后,将其放置于高压蒸汽灭菌锅中,根据前期实验结果在压力0.1 MPa、浸提温度133 ℃、浸提时间4 h对牛骨肉末中的蛋白质进行提取[21]。得到牛骨肉蛋白浸提液,冷却至50 ℃备用。

1.2.1.2 酶解 取上述浸提液,根据本实验室前期实验结果[22],采用双酶同步水解方式(0.06%的风味蛋白酶和0.03%的复合蛋白酶同时加入),酶解温度45 ℃,自然pH条件下酶解4.5 h,沸水浴灭酶20 min后立即冷却至30 ℃备用。

1.2.1.3 发酵 首先活化实验中所用到的萨科WBL-45、WBX-43、BOM-13和THM-17各菌株:分别称取菌株1 g,溶解在包含49 g牛奶、0.75 g葡萄糖组成的乳液中,混合均匀后常温放置2 h活化备用。在1.2.1.2的酶解液中分别接种各菌株,接种量均为0.02%,在30 ℃,130 r/min条件下振摇发酵12 h,作为4个实验组(分别为WBL-45、WBX-43、BOM-13和THM-17组),不接种菌株的作为对照(CK)组。

1.2.1.4 美拉德反应 参考李桂星[23]方法并稍作修改。发酵结束后,以1.3.1.3的发酵液的质量为基准,添加木糖1.2%、葡萄糖1.2%、半胱氨酸0.9%、甘氨酸0.45%、丙氨酸0.45%、VB11.8%后搅拌均匀,110 ℃条件下进行美拉德反应60 min,冷却、过滤后分别用电子鼻和电子舌分析牛肉调味基料的气味和滋味并对其进行感官评价。

1.2.2 感官评价方法 本实验感官评定小组由10名经过培训的食品专业成员组成(5男5女,年龄在23～45岁之间)[24]。感官评定之前,所有评定成员需在感官评定室待1 h以适应环境。感官评定时,将样品稀释10倍进行评定,所有评定人员不可以相互交流。具体评分标准见表1。

表1 牛肉调味基料香气评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of beef flavoring

1.2.3 电子鼻测定方法 直接顶空吸气法:取10 g样品,密封置于室温一段时间后依次进行测试。每个样品重复测定3次。电子鼻测试条件:采样时间为1 s/组,传感器自动清洗时间为60 s,传感器归零时间为10 s,样品准备时间为5 s,进样流量为5 mL/s,分析采样时间为100 s。

测定用电子鼻配有的10个高灵敏度金属传感器,具有不同的性能,能够代表不同类型的挥发性化合物[25](表2)。图1为电子鼻10个传感器对5组牛肉调味基料的响应值变化情况。

表2 电子鼻传感器性能描述Table 2 Composition of sensors in electronic nose and their performances

1.2.4 电子舌测定方法 将待测样品置于电子舌专用烧杯(25 mL)中待测。每个样品平行测定6次。

采用第5套传感器系统,包括SRS、SWS、BRS、STS、UMS、SPS、GPS共7根传感器,选择Ag/AgCl作为参比电极。其中前5种(SRS、SWS、BRS、STS、UMS)分别为对酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味敏感的传感器,能够反映不同样品五种滋味的相对强度大小。传感器经活化、校正后测样。

1.3 数据统计分析

实验重复进行3次。数据采用Microsoft Excel 2003计算各个指标的平均值和标准差,Statistix 8.1软件包中Linear Models程序进行,差异显著性(p<0.05)分析使用 Tukey HSD程序。采用SigmaPlot 10.0进行绘图。采用电子鼻和电子舌自带软件Alpha soft对检测结果进行主成分分析(PCA)。

2 结果与分析

2.1 感官评定结果

表3反映了不同菌种发酵的牛肉调味基料的香气感官评定结果。与未发酵的CK组相比,经微生物发酵后制成的牛肉调味基料香气得分会显著提高,不仅会产生特有的发酵香味,还能一定程度上增加产物的特征香气,赋予其饱满的肉香味和持久的回味感。不同菌种对牛肉调味基料的香气贡献作用不同,从表3可看出,WBL-45和WBX-43的赋香效果相似,而BOM-13组除了具有发酵香气外,其他特征均与CK组相近,这表明清酒乳杆菌的代谢产物对酶解液的影响较小,接种清酒乳杆菌不会显著增强调味基料的香气。经THM-17发酵制成的调味基料香气评分显著高于其他4组,呈现特有的发酵香气,且牛肉特征香气浓郁,肉香味饱满,这说明戊糖片球菌发酵能够释放更丰富的氨基酸、肽等风味前体物质,为美拉德反应提供充分的前体反应物,从而增强调味基料的香气。

表3 不同菌种发酵的牛肉调味基料感官评定结果分析Table 3 Sensory evaluation result analysis of beef paste flavoring fermented by different strains

2.2 不同菌种发酵的牛肉调味基料的电子鼻检测结果

2.2.1 响应值分析 从图1中可以看出,W1W传感器对5组牛肉调味基料的响应值均为最大,接下来依次是W2W、W5S和W1S传感器,其余传感器的响应值变化差异不显著(p>0.05),因此图中仅对影响较大的4个传感器响应值进行显著性分析,说明本实验制备的5组牛肉调味基料的主要挥发性成分为硫化物。由于每个传感器会对某一类特征气体响应强烈,能够用来反应样品中挥发性物质贡献率的大小,从而可以确定待测样品中的特征挥发性成分。响应值越高,表明此传感器对于该样品中挥发性物质的分析所起作用越大,反之,则说明该传感器所起作用较小。

图1 电子鼻10个传感器对5组牛肉调味基料的响应值变化图Fig.1 Effect of E-Nose 10 sensors on the response value of Beef paste flavoring注:图中小写字母表示不同传感器对同一样品的差异显著性,大写字母表示同一传感器对不同样品的差异显著性,相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同字母表示差异显著(p<0.05)。

实验发现,THM-17组的硫化物和芳香成分响应值显著高于其他4组(p<0.05),说明木糖葡萄球菌和戊糖片球菌协同作用对风味物质形成贡献最大。资料报道,戊糖片球菌具有较强的竞争性和环境适应性,可分泌蛋白酶、脂肪酶和过氧化氢酶,进而将蛋白质分解为小分子物质(肽和氨基酸),将脂肪分解为短链脂肪酸和脂类物质,促进良好风味生成[26]。此外,戊糖片球菌能够充分利用碳水化合物从而降低发酵体系的pH,不仅赋予其特有的风味,还能抑制病原菌和腐败菌的生长,提高产品的安全性[27]。木糖葡萄球菌能够促进蛋白降解,显著增加鲜味氨基酸的总量和比例[28]。两种菌复配后能够协同作用,使产品产生优良风味。

对于响应值最大的W1W传感器,WBX-43和BOM-13之间差异不显著(p>0.05),但它们均显著高于WBL-45和CK组(p<0.05),而WBL-45和CK组之间差异不显著(p>0.05)。说明经过微生物发酵过程,能够在一定程度上明显提高牛肉调味基料的风味。但菌种的种类和配比对风味形成影响很大,本实验说明采用THM-17菌株发酵,可以对牛肉调味基料的风味起到一定的增强作用。

2.2.2 主成分分析 主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是在对样品特性一无所知的前提下,通过降维处理对原始数据向量进行线性变换,得出最主要和贡献率最大的因子,从而寻找样品间差异的一种处理方法。PCA图可用来反映电子鼻能否将不同菌种发酵的牛肉调味基料区分开来。

由图2 可以看出,在Correlation相关性矩阵模式下,第一主成分贡献率为97.01%,第二主成分贡献率为2.44%,总贡献率达到99.45%,大于90%,表明这两个主成分能够用来反映样品的实际情况。每组椭圆代表着不同菌种发酵后的牛肉调味基料挥发性气味的数据分布,可以看出5组样品的电子鼻检测信号的特征区域完全没有重叠,说明电子鼻可以将不同菌种发酵的牛肉调味基料很好的区分开。PCA图中第1主成分的方差贡献率远大于第2主成分的方差贡献率,说明不同样品在横坐标上的距离越远,样品间差异越大;不同样品在纵坐标上的距离差异则不会显著影响样品间差异。从图2可以看出,经过发酵处理的4组与对照组在横坐标之间的距离远近依次为THM-17>WBX-43>BOM-13>WBL-45,这一结果与感官评价结果一致,均说明经过THM-17菌株发酵对牛肉调味基料的影响最大。

图2 不同菌种发酵的牛肉调味基料的PCA主成分分析Fig.2 Principal component analysis of beef paste flavoring fermented by different strains

2.3 不同菌种发酵的牛肉调味基料的电子舌检测结果分析

2.3.1 样品雷达指纹图谱 5组牛肉调味基料的滋味雷达指纹图谱见图3,滋味雷达图更能直观地反映样品在不同传感器的响应值有差别,图中的数值即反映不同传感器对样品的响应值,SRS、SWS、BRS、STS、UMS分别代表5根传感器,即酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味。由图3可以看出,除CK组以外,电子舌5根传感器对其他4组牛肉调味基料的信号响应图谱较相似。总体来看,UMS(鲜味)和STS(咸味)所代表的传感器响应值较高。说明微生物发酵能够形成鲜味物质,经发酵的4组牛肉调味基料的鲜味响应值均为7,显著高于CK组的鲜味响应值2。SRS传感器代表的是对酸味较为敏感,从雷达图可看出,5组牛肉调味基料的酸味大小依次为CK>THM-17>WBL-45>WBX-43>BOM-13,且经过发酵处理的4组酸味值较接近,均低于CK组。从BRS(苦味)传感器响应值可看出,未经发酵处理的CK组苦味值远远高于其他4组(p<0.05),这是因为微生物代谢酶系能够进一步分解苦味肽[29],从而降低苦味值,说明采用发酵工艺能够明显改善产品的口感。

图3 不同菌种发酵的牛肉调味基料雷达指纹图谱Fig.3 Radar fingerprints of beef paste flavoring fermented by different strains

2.3.2 主成分分析 实验采用电子舌自带软件Alphasoft V14.2对检测到的5组牛肉调味基料的信号值进行主成分分析,以第1主成分为横坐标,第2主成分为纵坐标绘制二维图,如图4所示。从图4可以看出,第1主成分(PC1)与第2主成分(PC2)的贡献率分别为96.585%和3.078%,二者之和达到99.663%,说明主要成分能够很好地反映样品的实际情况,电子舌能够将5组牛肉调味基料很好地区分开来,由此证明5组牛肉调味基料在滋味上存在明显差别。主成分分析图中,样品间的相对距离越小,样品滋味越接近。即样品BOM-13与WBX-43在滋味上区别较小,样品THM-17与CK组的区别较大,说明清酒乳杆菌对牛肉调味基料的风味贡献作用较小,而戊糖片球菌对其则有较强的赋香作用。

图4 不同菌种发酵的牛肉调味基料的PCA主成分分析Fig.4 Principal component analysis of beef paste flavoring fermented by different strains

电子舌鉴定结果表明本实验所选用的菌株对牛肉调味基料均具有增鲜作用,而不同菌种由于产酸能力和代谢成分不同赋予产品的呈味效果也不一样,今后需结合菌株的代谢途径进一步分析其与风味物质形成的关系。

3 讨论

生肉只有通过煎、炸、炖、煮、烤等加热手段后才能产生诱人的香味,这些香味物质主要是由肉本身所含有的微量香味前体物质在热加工过程中发生的一系列复杂化学变化形成的[30]。肉中的肉香味前体物质主要有两类:一类是氨基酸、核苷酸、肽、硫胺素以及还原糖,它们可通过热反应产生基本肉香味物质,主要是含硫化合物,这与本实验电子鼻检测结果一致(见2.2.1);另一类是甘油三酯、磷脂和脂肪酸,通过热降解产生特征肉香味。氨基酸、肽等小分子物质是由蛋白质水解形成,通常采用酸碱法、酶法和微生物发酵法制得[31]。酸碱法水解彻底,氨氮含量高,成本较低,但其属于化学水解,容易产生微量有害物质氯丙醇[32]。酶法水解的蛋白味道柔和纯净,可作为美拉德反应生产肉味香料的良好底物,然而使用此类蛋白水解物生产的肉味香料带有苦味,这是因为随着酶解程度的加深,越来越多的疏水性氨基酸暴露出来,进而导致苦味增加[33]。微生物在代谢过程中会分泌一些酶类,可将骨类蛋白质或多肽适度水解,不形成苦味肽,甚至能脱除苦味,并提高氨基态氮的含量,增强产品风味。Michiko M等人利用E,iinaAannas细菌与胃蛋白酶水解的酪蛋白水解液作用,发现微生物具有直接脱苦效果。刘通讯[25]从鸡肉酶解液中提取苦味肽,分别接种乳酸菌和酿酒酵母,通过对游离氨基酸释放情况的检测并对苦味进行评分,揭示了酶解液中苦味的本质,结果表明乳酸菌和酵母有肽酶体系,它们有能力将苦味肽进一步水解,使苦味肽的苦味减弱甚至完全消失。解铭[34]对鳕鱼脱苦方法进行研究,经过研究脱苦的多肽含量、疏水性指数以及蛋白酶和氨肽酶酶活,结果发现酵母酶系有脱苦作用。

本实验未经发酵的CK组苦味分值远远高于其他4组(见2.3.1),说明酶解过程使得疏水性氨基酸暴露出来,形成苦味肽,接触味蕾产生苦味。通过接种微生物发酵,能够显著降低苦味值,且发现清酒乳杆菌和戊糖片球菌的脱苦效果高于木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌。但具体脱苦机制尚不清楚,需要对微生物代谢过程中的产酶体系进行研究,进一步解释其脱苦作用机理。

从特有发酵香味角度分析,发酵肉制品中常用的微生物有霉菌、酵母菌和细菌。本文选用乳酸菌(清酒乳杆菌和戊糖片球菌)和葡萄球菌(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)。乳酸菌能够产生乳酸和细菌素,不仅促进良好风味的产生,还能降低体系的pH,抑制腐败微生物的生长和细菌毒素的形成,提高产品安全性[35]。徐玮东等[36]发现接种清酒乳杆菌可加速发酵香肠的成熟过程,并且能够降解肌肉蛋白,生成游离氨基酸进而促进风味的形成。葡萄球菌含有蛋白酶和脂肪酶,能够降解蛋白质和脂肪,对芳香气味的形成具有优势作用。Stahnke L H[37]比较了不接菌和接种一株木糖葡萄球菌的香肠的风味,结果发现接种木糖葡萄球菌的香肠具有一种水果味。结果还表明萨拉米的特征风味跟乙酯类和烷烃类物质有关,而接种木糖葡萄球菌的发酵香肠可以产生这类挥发性成分。Berdagtle等研究结果指出葡萄球菌和微球菌能够促进干香肠芳香气味的形成。

通过感官评定结合电子鼻和电子舌检测结果表明，经微生物发酵处理的牛肉调味基料均与未发酵的对照组具有明显差异,且不同菌种发酵的牛肉调味基料气味和滋味之间区别较为明显。为便于探讨微生物发酵工艺对天然牛肉调味基料风味增强的机理,需要对发酵液中游离氨基酸、游离脂肪酸进行测定,并对其美拉德反应后的调味基料中滋味成分(核苷酸关联化合物)进行测定,再结合GC-MS对其挥发性化合物得分析结果,建立风味与蛋白、脂肪降解之间的关系,进而探讨微生物发酵工艺对天然牛肉调味基料风味的增强效果。

4 结论

实验发现,在传统调味基料加工工艺基础上,增加微生物发酵工艺,对牛肉调味基料可起到明显的赋香效果,但接种不同菌种会影响牛肉调味基料的风味形成。感官评定结合电子鼻和电子舌检测结果表明,与本实验所用的其他菌种相比,接种THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌)的牛肉调味基料在气味和滋味上与未发酵的CK组之间差异最大(p<0.05),接种THM-17菌种将酶解液进一步发酵再进行美拉德反应,可以得到风味最佳的天然牛肉调味基料,说明选择适宜的发酵菌株增加发酵环节,可以对调味基料起到明显的赋香效果,研究结果可为实际生产提供数据支持。

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