宁夏主要水稻品种(系)Rf-1基因位点多态性分析

王 坚，刘 炜

(宁夏农林科学院 农作物研究所,宁夏永宁 750105)

遗传基础不同的植物，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如生活力、适应性、生殖力、生长势、抗逆性，以及产量、品质等，这称之为杂交优势[1]。杂种优势的大小与亲本间的遗传背景有很大的关系。水稻中籼稻和粳稻之间有较远的遗传关系，在形态学、生物化学和分子遗传学方面有很多差异[2]，杂交后代往往会产生大量遗传重组和分离类型，产生很强的杂种优势, 在杂交稻育种实践中具有潜在的巨大价值[3-4]。因此，明确亲本间的遗传背景和关系、调节搭配亲本组合及其籼粳成分, 使北方杂交水稻能获得高产稳产成为了现阶段研究的重点[5]。

在粳型杂交稻中，育种家先后转育成一大批BT型粳稻不育系[6]，但广泛测恢均未能找到粳稻恢复系, 因此认为粳稻中没有恢复基因[7]。 杨振玉等[8]利用“籼粳架桥”制恢方法，从籼稻中找到可以利用的恢复基因，至此粳型杂交稻三系配套成功。随着生物技术的快速发展，其关键基因Rf-1被定位和克隆，Rf-1位点2个相关的育性恢复基因Rf1a和Rf1b基因，RF1A上位于RF1B。粳稻不育/保持系(rf1/rf1)与籼型或粳型恢复系的恢复基因(Rf1/Rf1)在Rf1a位点上存在1 bp和574 bp两处缺失，在Rf1b位点上存在多处差异[9-10]。大量的研究也表明，水稻Rf-1 位点在籼粳分化地区具有较高的遗传多样性[11-13]，与水稻的籼粳分化紧密相关[14]，是籼粳分化重要区分性状之一。

宁夏水稻最早来自籼粳稻交替地区陕西秦岭、巴山等地区[15]。加上近些年，从不同地区引种杂交，籼型血缘的水稻不断导入到宁夏水稻。为此我们对在宁夏种植过的主要品种(系)Rf-1位点进行分析，明确Rf-1位点规律和特点。为不育系或恢复系的转育，转育过程中分子标记选用，各品种的遗传类型、种群的划分、杂交组合配置和杂种优势的利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

选用的材料主要来自在宁夏种植或引进的品种(系)共49个材料, 基本信息详见表1。

1.2 引物设计及其扩增效果验证

根据Rf1a基因位点保持系(rf1a/rf1a)比恢复系(Rf1a/Rf1a)缺少574 bp的片段[9-10]，在缺失区域上游设计引物Rfa-7F(GGACCGGGGGATTTTACCTG)，下游设计引物Rfa-7R(AACCCAACTGAGACCATGCC)[16]。根据Rf1b基因序列(GenBankDQ311054.1)，设计引物Rfb-1F/Rfb-1R(ttctcgtcgtctt-cttcccg/ctttaggcccctcttgacca)和 Rfb-2F/Rfb-2Rc-aatggacaaggccatggag/tgtaggccatttcaaacagga)对各品种(系)扩增，由金唯智公司对扩增片段进行测序。

1.3 粳稻DNA的提取和PCR扩增

将宁夏的主要品(系)种植于宁夏农林科学院农作物研究所实验基地，2016年4月中旬大棚育秧，5月中旬单株插秧，在水稻3～4叶期取新鲜叶片，采用CTAB法提取DNA。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系总体积为20 μL，其中10×Buffer(含Mg2+15 mmol/L) 2 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，100 μmol/L引物各0.1 μL，1 UTaq酶，DNA模板1 μL，加ddH2O补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环; 最后72 ℃延伸10min。扩增产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳，用Gold-View核酸染料染色后在紫外灯下观察，并用凝胶成像系统拍照。

2 结果与分析

2.1 宁夏主要水稻Rf1a基因位点检测

用Rfa-7F/Rfa-7R引物对宁夏这些主要品种(系)的DNA进行扩增，结果(图1)表明，其中‘宁香稻1号’、‘宁粳29号’和‘宁粳30号’等11个品种(系)扩增出957 bp片段，(Rf1a/Rf1a)基因型占了22%，其余的扩增出383 bp的片段，(rf1a/rf1a)基因型占了78%。

2.2 宁夏主要水稻Rf1b基因位点检测

各突变位点在实验品种中出现的频次见表2，其中2459、2283、2059、1694、2205、1784、2315位点在各品种中突变的频率较高，各突变出现的次数在39～48次。1927、1117(1118)、1530(1546)位点出现的位点频率相对少一些，各突变出现的次数在11～21次。1576、1881、1970(1985)位点发生突变极少，各突变只出现1次，其共同特点是在该位点后插入1个碱基。

表1 宁夏49份主要水稻品种(系)的基本信息

WB01～WB49. 同表1；M.DL2000图1 宁夏49份主要水稻品种(系)Rf1a基因位点功能标记分析WB01-WB49 are shown in Table 1; M：DL2000Fig.1 Functional mark analysis of main rice varieties (lines) in 49 rice samples at Rf1a gene locus

突变位置Mutationposition数量Quantity突变位置Mutationposition数量Quantity1117(1118)191927211233111970(1985)11530(1546)142059471576122054616944722834717844623153918811245948

通过引物Rfb-1F/Rfb-1R和Rfb-2F/Rfb-2R对这些品种(系)DNA进行扩增并测序，结果与Rf1b基因序列对比，有17个点的碱基发生突变(表3)，分别在1117位点G变为T,1118位点C变为T，1233位点C变为T，1530位点C变为T,1546位点G变为A，1576位点A变为AC，1694位点C变为T，1784位点C变为T，1881位点T变为TC，1927位点C变为A，1970位点A变为AG,1985位点A变为AG，2059位点T变为G，2205位点T变为C，2283位点C变为G，2315位点A变为G，2459位点G变为C。其中1117和1118位点，1530和1546位点，1970和1985位点表现为同时突变，在统计分析过程中将其归为同一点。

各品种突变位点数详见表4。由表4可知，只有1个品种有10个突变位点，22个品种有9个突变位点，其余的品种都小于9个突变位点，13个品种有8个突变位点，6个品种有7个突变位点，4个品种有6个突变位点，2个品种有5个突变位点，由此可以看到随着突变位点的减少品种数也呈指数下降，少于5个的突变位点则没有。‘宁粳32号’一个品种的序列与Rf1b基因完全一样。

2.3 宁夏主要水稻Rf1基因位点聚类分析

利用DPS软件，根据计算出来的群体内种质间的Nei和Li遗传相似系数，采用可变类平均法对49份水稻材料进行聚类分析，并绘制树状聚类图，结果如图2所示。以遗传距离1.25进行划分，可以划分为三类，第一类有‘宁粳43号’、‘宁粳24号’和‘宁粳 12号’等共13个品种。都是在1117(1118)、1694、1784、1927、2059、2205、2283、2315、2459位点发生突变，在1233、1530(1546)、1576、1881、1970(1985)位点无突变，突变位点多样性单一。第二类有‘楚粳28号’、‘农科843’和‘宁粳27号’等共11个品种。在1233、1694、1784、2059、2205、2283、2315、2459位点全部品种(系)发生突变，在1117(1118)、1576、1927、1970(1985)位点所有品种(系)无突变，1530(1546)位点多数品种(系)发生突变，1881位点只有少数品种(系)发生突变。品种间的差异主要在1881和1530(1546)位置变化。第三类有‘吉粳105’、‘宁粳44号’和‘稻京29’等共25个品种。只有1233和1881无品种发生无突变，其他位置的都有突变，而且品种间的差异非常大。

表4 宁夏49份主要水稻品种(系)各品种突变位点数

材料编号No.突变位点数Numberofmutationlocus材料编号No.突变位点数Numberofmutationlocus材料编号No.突变位点数Numberofmutationlocus材料编号No.突变位点数NumberofmutationlocusWB018WB149WB2710WB399WB029WB159WB280WB406WB039WB169WB299WB418WB049WB179WB307WB428WB057WB189WB318WB435WB069WB198WB328WB447WB079WB209WB337WB458WB089WB219WB348WB468WB099WB228WB356WB479WB109WB238WB368WB486WB115WB249WB377WB498WB129WB257WB389WB139WB266

WB01～WB49同表1图2 宁夏49份主要水稻的Rf-1基因位点聚类分析树状图WB1-WB49 are shown in Table 1Fig.2 Tree diagram for Rf-1 gene locus cluster analysis of 49 rice varieties in Ningxia

3 讨 论

突变基因组为进化的主要动力[17-18]，发生突变的栽培稻，为适应不同的生态环境，在自然和人工的共同选择产生籼稻-粳稻分化[19-21]，因此籼、粳稻在分子生物学方面出现非常大的差异[22-24]。通过对宁夏的主要品系Rf1b基因序列对比，结果有多处的位点发生突变，每个突变位点出现的频率不同。突变的类型主要是碱基的替换，而且变化位点多，品种间的变化大。插入突变位点相对少，只有少数品种(系)发生插入突变，这可能是由于碱基的替换高于插入突变[25]。

根据Rf-1基因不同突变位点，可以将宁夏主要的品种划分3个类群，第一类群多数属于早期育成的品种(系)，第二类群多数属于较晚育成的品种(系)，第二类群比第一类的多样性增加，突变点的数量减少。第三类群的品种多数属于较近时期的品种(系)，突变位点多样性增加，但突变点数量减少更多。 总体看第一类群体到第三类群体，品种间突变位点的差异增加，多样性更丰富，突变点的数量有下降趋势。这些发展趋势可能与不同时期的目标和使用亲本材料更加丰富有关。早期育种目标主要就是高产，育种过程中选用的亲本单一。随着人们生活水平不断的提高，品种不仅要高产还要品质好，近些年对品种的要求更高，在高产、优质、抗性好和广适应等多方面都提出了更高的要求。籼粳稻杂交其后代疯狂分离、变异幅度大、杂种优势强，蕴藏巨大的遗传潜力[26-27]，已经成为国内外水稻重要的育种策略和方法[28]。通过“籼粳架桥”使籼粳稻之间的基因交流更容易，利用籼粳稻杂交创造新株型和强优势，选育理想株型与优势利用相结合的超级稻等育种理论与技术路线确立[29-30]，不同地区的品种相互交流更多，籼粳血缘相互渗透更加广泛， 在这种大的育种背景下，宁夏的品种背景也变得更复杂，增加更多的籼型血缘。这些可能导致Rf-1基因在不同突变位点的差异增加和突变点的数量下降趋势。

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