杂交兰 ‘黄金小神童’ 四倍体诱导技术研究

2018-04-25李慧敏杨少杰瞿素萍

西南林业大学学报 2018年2期

李涵李慧敏陆琳杨少杰瞿素萍田敏黎霞曹桦

(1. 云南省农业科学院花卉研究所，国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明 650100；2. 云南省科学技术院，云南昆明 650100)

杂交兰 ‘黄金小神童’ (CymbidiumGolden Elf ‘Sundust’) 是大花蕙兰 (Cymbidiumhybridum) 与四季兰素心 (Cymbidiumensifoliumvar.rubrigemmum‘Suxin’) 的杂交种[1-2]，花型较大、香气雅致、鲜艳夺目、纯正黄色，因而又被称为 “黄花素心”[2]。黄金小神童四季都可开花，可控制花期，满足人们的喜好，既可赏花又能闻香[1,3]，具有重要的观赏价值和经济价值，市场前景可观。近年来，多倍体育种在植物新品种选育中应用广泛，推动了植物的进化[4]。多倍体染色体数目加倍，个体外形表现巨大性，色泽鲜艳，细胞内含物增加[5-6]；表现出耐辐射、耐紫外光、抗性较强[7-8]，花型巨大、花色艳丽等特征，这对观花植物来说具有十分重要的研究价值。

目前，兰花多采用秋水仙素进行化学诱变，在大花蕙兰[9]、石斛 (Dendrobiumnobile)[10]、蝴蝶兰 (Phalaenopsisaphrodite)[11]、黄婵兰 (Cymbidiumiridioides)[12]多倍体诱导上获得成功。但作为化学诱变剂，秋水仙素存在诱导率低、毒性大等缺点，对人和环境具有很大危害。安磺灵是一种新型的除草剂，具有与植物蛋白亲和力高、与动物蛋白亲和力低的特点，因此诱导植物多倍体效率高、环境污染小[13-15]。甲基黄酸乙酯 (EMS) 是一种常用的化学诱变剂，具有操作简单、突变频率高、突变专一性与多效性等优点[16]。目前，运用各种化学诱变剂育种的报道较多见，但运用2种或2种以上化学诱变剂的鲜见报道。本研究通过EMS和安磺灵2种诱变剂组合使用，目的在于提高杂交兰诱变率、快速获得稳定性好的四倍体株系以降低多倍体育种成本，为杂交兰多倍体育种研究提供理论数据，期望能选育出观赏价值高、抗性好的杂交兰新品种；同时，为化学诱变在诱变剂使用上提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在云南省农业科学院花卉研究所基地内选取市场流行品种杂交兰 ‘黄金小神童’ 茎尖为外植体材料，在诱导培养基MS + EMS 20～70 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 琼脂7 g/L，pH值为5.4～5.8条件下，诱导获得根状茎；在分化培养基MS + 6-BA 5 mg/L + NAA 1 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 花宝1号2.5 g/L + 花宝2号0.6 g/L + 花宝5号0.8 g/L + 琼脂7 g/L中，经pH值5.4～5.8分化得组培苗。建立成熟组培快繁体系。组培苗经过鉴定，根尖染色体数目为2n=2x=40，为二倍体植株。无菌条件下，取1 cm长的健壮根状茎作为诱导多倍体的基础材料。培养室培养温度 (25 ± 1) ℃，相对湿度70%～80%，光照强度1 000～2 000 lx，光照12 h/d。

1.2 实验方法

1.2.1多倍体诱导

以安磺灵和EMS作为诱导剂，采用复合化学诱变剂诱导的方法，对杂交兰根状茎进行多倍体诱导。依照实验设计，按不同比例配比2种诱导剂，对 ‘黄金小神童’ 根状茎进行诱导。无菌条件下，取根状茎中断，生长健壮的1 cm根状茎，用浓度为0、0.001%、0.002%、0.003%对其进行浸泡，处理时间分别为24、48、72 h，后用灭菌蒸馏水清洗3次，灭菌滤纸吸干水分。后接种到含有不同EMS浓度 (0、20、50、70 mg/L) 的无菌固体培养基中，培养基配方为MS + EMS 20～70 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 琼脂7 g/L，pH值为5.4～5.8，进行无菌诱导培养，1个月后，统计死亡率。后把存活根状茎转接到分化培养基MS + 6-BA 5 mg/L + NAA 1 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 花宝1号2.5 g/L + 花宝2号0.6 g/L + 花宝5号0.8 g/L + 琼脂7 g/L中，pH值为5.4～5.8进行培养；60 d后根状茎形成组培苗，长出幼嫩根，初步观察其形态变化，统计变异率。

1.2.2变异植株形态鉴定

处理过后的根状茎，经过分化成苗，部分植株会呈现粗壮、叶色浓绿、叶片宽大肥厚、叶片卷曲的形态特征。把具有这些形态特征的植株初步判定为多倍体植株，进行初步的筛选和变异率的统计，随机选取二倍体单株和变异单株各30株，测量叶长、叶宽、叶厚、株高、茎粗。

1.2.3变异植株气孔鉴定

选择天气晴朗的上午8:00—11:00，气孔持张开状态，随机选取杂交兰二倍体植株材料和变异植株材料同一部位的新鲜叶片各30片，用镊子轻轻撕取叶片中部的下表皮，置于载玻片上，制作临时玻片。40倍光学显微镜随机测量气孔10个，微尺测量气孔和保卫细胞的长和宽，检测10个不同的视野，求其平均值。

1.2.4多倍体染色体鉴定

采用F-BSG法在9:00—12:00，细胞分裂旺盛时期，取变异植株的幼嫩根尖1～1.5 cm装入离心管中，分别对植株和根尖编号。用质量浓度为0.1%的秋水仙素浸泡4 h后，清洗，卡诺固定液 (V(无水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1) 固定20～24 h后，清洗，然后用浓度为1 mol/L的盐酸在60 ℃下解离8～10 min，清洗，把根尖放在载玻片中央，滴2～3滴卡宝品红染色液，染色3～5 min，从染液的一角轻轻盖上盖玻片进行压片，用新铅笔有橡皮头的一端轻敲盖玻片，使根尖均匀分散。用Nika显微镜 (Eclipse E800) 镜检拍照，跟据染色体数确定其倍数。

1.2.5多倍体的稳定

经3种方法鉴定筛选的变异植株，接种到MS + 6-BA 3 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 蛋白胨2 g/L + 蔗糖25 g/L + 香蕉100 g/L + 活性炭3 g/L + 琼脂7 g/L培养基中，并在温度 (25 ± 1) ℃、光照强度1 000～2 000 lx、光照12 h/d的条件下进行继代培养。继代培养长出根状茎，重新进行切割，经诱导、分化成苗、生根后取根尖染色体鉴定，同一变异植株经过3次分离稳定及鉴定，染色体数目稳定一致，确定变异植株为四倍体，进行增殖培养。

2 结果与分析

2.1 安磺灵和EMS复合诱导杂交兰根状茎的诱导效果

以植株外部形态变异和气孔显著增大为初步鉴定指标。死亡标准是指养1个月后仍不能发育，以后根状茎逐渐死亡。由表1可知，杂交兰根状茎以安磺灵浓度为0.002%处理48 h，EMS浓度为50 mg/L加入培养基培养1个月的变异效果最佳，变异率为52%，死亡率仅为6%。随着安磺灵和EMS浓度的增加，死亡率有所增加，但差别不显著，最高死亡率为10%。

表1 安磺灵和EMS不同浓度和处理时间对杂交兰根状茎的诱导效果Table 1 The induction effects of different concentrations and treatment time of oryzalin and EMS on Cymbidium rhizome

0.001%～0.003%安磺灵处理24～72 h后均有不同程度的变异植株出现，变异率为16%～44%。根状茎不经过安磺灵浸泡直接接入含有EMS 0～70 mg/L的培养基中培养变异率较低，变异率为0～4%。2种诱变剂配合使用变异效果显著。

2.2 多倍体植株的鉴定

2.2.1外部形态鉴定结果

观察发现杂交兰根状茎经过处理培养1月后 (图1)，与对照根状茎相比，生长速度较缓慢，分化出的根状茎更粗状，表面突起较明显，伴轻微玻璃化。将诱导处理过的根状茎分化培养形成植株，部分植株生长缓慢，株型紧凑矮状，叶片增厚，叶脉较深，叶色深绿，部分叶片扭曲，叶尖分叉。对照植株叶片光滑、质薄、叶色浅。诱导后的根状茎和分化的植株与对照植株的在外部形态上有明显区别，多倍体叶长和株高指标相对二倍体降低2.79%和2.92%，差异不显著；多倍体叶宽、叶厚和茎粗指标与二倍体相比增加31.74%、39.28%和37.85%，差异极显著，见表2。

图1多倍体与二倍体根状茎和株型比较
Fig.1 Comparison of rhizome and strain between polyploid and diploid

表2 多倍体与二倍体植株外部形态的比较Table 2 Comparison of external morphology between polyploid and diploid strain

2.2.2气孔鉴定结果

选择正常植株与多倍体植株各4～6片全展叶，取相同部位的叶片下表皮在显微镜下观察气孔，测量气孔和保卫细胞的长宽，见表3。由表3可知，杂交兰多倍体植株叶片气孔形态特征与二倍体的基本相似，但气孔大小差异显著；多倍体植株叶片单位面积的气孔数较二倍体少，气孔增大。多倍体气孔长和宽、保卫细胞长和宽分别比二倍体增加了28.45%和30.27%、28.10%和34.08%，气孔密度比二倍体降低了38.23%。

表3 多倍体与二倍体气孔大小的比较Table 3 Comparison of the stomatal size between polyploid and diploid

2.2.3染色体鉴定结果

将外部形态鉴定和气孔鉴定后的变异植株进行生根，采用根尖压片法鉴定其染色体数目，见图2。二倍体材料细胞染色体数为2n=2x=40，诱导处理后的变异植株染色体数目增多，且根尖细胞体积明显增大。其中，大量细胞染色体数目为2n=4x=80，还出现40～120条染色体数目不等的情况，这可能是植株染色体小、染色体重叠、茎尖细胞核粘稠、细胞出现嵌合体等原因。

对安磺灵浓度为0.002%处理48 h，EMS浓度为50 mg/L加入培养基培养1个月的实验组进行变异植株的初步筛选，得到40%的四倍体 (2n=4x=80)，再进行继代培养增殖后进行染色体鉴定，变异的根尖细胞中四倍体的比例为80%。再次把筛选出来的四倍体进行继代培养增殖后进行鉴定，得到四倍体比例为90%。

图2杂交兰二倍体和四倍体染色体
Fig.2 Chromosome of diploid and tetraploidCymbidium

3 结论与讨论

安磺灵和EMS作为高效的化学诱变剂，逐渐被诸多学者运用到不同的植物诱变研究中，然而，这2种高效诱变剂组合诱变的研究却未见报道。本实验采用安磺灵浸泡处理结合EMS混培法对杂交兰 “黄金小神童” 进行诱导，在所有实验组中，根状茎的最高死亡率仅为10%，说明安磺灵和EMS对根状茎伤害程度较小。其中，又以0.002%安磺灵浸泡48 h，并接种到含有50 mg/L EMS培养基中培养1个月的实验组，根状茎的诱变率最高，达52%，死亡率仅为6%，且含高达40%的四倍体。继代培养后，四倍体比重呈梯度上升。综合各实验组发现，相比单一诱变法，组合诱变法的诱变率显著提高，死亡率显著降低。诱变得到的杂交兰多倍体组培苗材料显现出多倍体的性状，即生长缓慢，植株矮小粗壮，叶片颜色变深增厚等。因此选择安磺灵和EMS组合诱变具有高效性、独创性和科学性，可将本实验方法推广至其他兰花或植物品种的四倍体研究中。

自然界中高等植物四倍体的发生机率极低，一般采用秋水仙素等诱变剂进行单一诱变，然而，诱变率低、毒性大等因素大大地限制了四倍体在实际生产中的应用。实验中，上述氨磺灵及EMS组合诱变四倍体的方法是非常高效且环保的新方法，也为下一步新品种的选育及继续创造提供了依据。

在杂交兰诱导领域中，使用秋水仙素等化学诱变剂对植物组织和细胞有较强的毒害作用，且使用时浓度难以控制[17]；王爱华等[18]以秋水仙素诱导铁皮石斛2n花粉得到6.22%的诱导率，王木桂等利用秋水仙素对墨兰进行诱导得最高诱变率19.44%[19]，季碧霞等[20]在对大花蕙兰多倍体的研究中，用秋水仙素对其进行诱导，最高诱导率为28.2%，最低死亡率为7.3%；李雪娇等[21]对云南野生碧玉兰的研究中，以秋水仙素诱导其无菌试管苗，最低死亡率为30%；石从广等[22]利用EMS对甘蓝型油菜进行诱变时得8.46%的诱变率；而本实验中氨磺灵与EMS组合使用所得到的最高诱变率达52%，最低死亡率为6%。因此，相对于单一诱变剂来说，氨磺灵与EMS组合诱变的方法具有绝对的高效性和安全性。

本实验中所获得的四倍体材料将直接进行移栽炼苗，测量多倍体移栽成活率。成活后进行田间定期观察并测试性状的变化，同时对四倍体性状是否稳定进行比测。植株开花后，观察花朵的性状，希望能够筛选出优良的多倍体新品种，为兰花种质资源创新提供基础数据。

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