新疆尼勒克县牛布鲁菌病及新孢子虫病流行病学调查

段永只， 张 杨， 吾力江， 杜兰兰， 李才善， 巴音查汗

(新疆农业大学动物医学院， 新疆 乌鲁木齐 830052)

布鲁菌病是由布鲁菌侵入机体引起的变态反应性人兽共患传染病，可引发流产、不孕和各种组织的局部病灶，简称布病。 该病广泛分布于世界各国，不仅严重危害畜牧业的发展，而且对人类的健康带来巨大威胁。 布鲁菌病的传染源主要为患病动物，病畜可长期或终生携带布鲁菌，对其他动物和人类具有一定程度的威胁。 病原菌在水和土壤中存活72 ～112 d，在乳内存活3 ～15 d，在冷暗胎儿中存活6 个月，故该病可随患畜的流产物、乳汁、尿液排出体外，通过被污染的草场、圈舍、饲料等引起动物感染。 感染途径以消化道、呼吸道、生殖道为主，也可通过眼结膜、生殖道和损伤皮肤感染。

新孢子虫病是由寄生于多种动物有核细胞内的犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的繁殖障碍性的原虫病。 该病即可垂直传播也可水平传播，怀孕母畜感染出现流产、弱产、产死胎等；新生儿则多表现为四肢运动障碍和神经系统疾病等。 新孢子虫可以感染多种的哺乳动物，该病呈全球性分布，给养殖业带来了巨大的经济损失[1-3]。

近年来，畜牧业在我国得到迅速发展，牲畜的流动和交易日益频繁，该病制约了畜牧业发展及造成重大经济损失和严重公共卫生问题。 本次试验选择新疆尼勒克县作为调查点，于2016 年2 月至2017 年5 月在尼勒克县范围5 个区域进行了牛布病及新孢子虫病的流行病学抽样调查，为逐步防控布鲁病和新孢子虫病提供相关流行病学数据。

1 样品来源

2016 年2 月至2017 年5 月对尼勒克县范围5个区域采集不同性别牛血样1 966 份，分离血清，同时记录牛只的编号、年龄。 -20 ℃冷冻保存，待检。

2 试剂与器材

布鲁菌病虎红平板凝集试验：抗原、标准阳性血清、标准阴性血清(哈药集团生物疫苗有限公司生产，生产批号：201703，规格：5 mL/瓶)；羊抗牛血清玻璃板；A4 纸其上划分成4 cm2的方格；吸管或移液器；牙签。

新孢子虫病rELISA 试验：兔抗马IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；羊抗牛血清(BETHYL公司)；兔抗羊血清、NcSRS2 重组抗原、TgSAG2 抗原(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；标准阳性、临床阴性血清(美国IDEXX 生物科技有限公司)。

3 试验方法及判定标准

3.1 虎红平板凝集试验 将血清和抗原在室温放置30 ～60 min；将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清0.03 mL；在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原0.03 mL；用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在白炽灯下5 分钟内观察结果；每次试验应设阴性血清、阳性血清对照。

判定结果：受检血清在4 min 内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性( +)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性( -)。

3.2 新孢子虫病的rELISA 检测方法 严格参照文献[4]建立的rELISA 方法进行检测。

新孢子虫地方虫株NcSRS2 重组抗原，按7 μg/mL剂量加到包被液中(50 mmol/lcarbonate bicarbonate buffer，pH 值9.6)，混匀后加到96 孔平底微量板(Nunc，Denmark)的孔里，每孔100 μL，并且在4 ℃条件下培养过夜。 用含有0.05% Tween20 的PBS冲洗3 次后，残留粘附物的部位用含0.5%脱脂乳的封阻液进行封阻，每孔200 μL，并在37 ℃条件下培养1 h。 微量板用冲洗液冲洗3 次，在封阻液中按1∶100 的滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的2 个孔中，每孔100 μL，并在37 ℃条件下培养1 h。 用冲洗液冲洗3 次后，在封阻液中按1∶4 000的滴度稀释用辣根过氧化物酶结合了的羊抗牛的IgG 抗体，稀释后每孔加50 μL，并在37 ℃条件下培养1 h。 用冲洗液冲洗6 次后，每孔加100 μL 底物-四甲基联苯胺(TMB)室温孵育25 min 后终止反应，在620 nm 波长下读板并记录OD 值。

判定标准：参照试剂盒的标准，阴、阳性临界值定义为阴性血清平均OD 值¯X + 3SD。 即当OD450/OD630值≥+ 4SD 时判为阳性；当OD450/OD630值＜¯X+2SD 时判为阴性；当¯X +2SD≤OD450/OD630值＜¯X+4SD 时判为可疑阳性，重新做检测，若检测结果仍为疑似阳性的则判定为阳性。

4 试验结果

对1 966 份牛血样全部进行了检测。 其中布病检测结果显示，阳性血样51 份，阳性率为2.59%。其中新孢子虫病检测结果显示，阳性血样26 份，阳性率为1.32%。 经调查，检测样品中，有97 头牛有过流产现象，其中，51 头感染布病，26 头感染新孢子虫病，无交叉感染。 见表1、表2 及表3。

表1 布病虎红平板凝集检测试验

表2 新孢子虫rELISA 检测

表3 流产牛中感染两种疾病的感染率调查结果

5 讨论

牛布鲁菌病和新孢子虫病是导致牛流产的主要原因。 近年来，该地区流产牛的病例逐年上升，严重影响畜牧业发展及畜产品生产。 新疆尼勒克县位于中国新疆西北部，隶属于伊犁哈萨克自治州，属于以牧为主，农牧结合的偏远山区县，据统计，该县2015 年牛存栏量为22 万头，当地牛只饲养方式主要为草场散养及圈养，且每年有外来引进牛只。 为调查该地区牛布病及新孢子虫病的感染情况，以尼勒克县5 个地区采取血样1 966 份，经检测，布鲁菌病感染率为2.59%；新孢子虫病感染率为1.32%。 经调查，检测样品中，有97 头牛有过流产现象，其中，51 头感染布病，26 头感染新孢子虫病，无交叉感染；这两种疾病的发生正是导致流产的主要原因。

导致该病的主要原因：(1)畜主缺乏对布病及新孢子虫病的认识及防护意识薄弱；(2)饲养量不断增多，免疫(未做到一针一畜)、病畜及流产物处理等易感染发病；(3)冬、夏季草场跨区域较多、牲畜频繁转场及调运；(4)工作经费及人员等相关问题，检测筛查并不完全，对检出阳性布病牛只需扑杀牲畜也没有做到完全净化；(5)异地引畜逐年增加，对引进牛只的检查不完善，通过牛只自然交配，加快了布鲁菌病及新孢子虫病的传播速度。

布病及新孢子虫病的防治以免疫和检疫为主，应采取“检、隔、免、杀、消”等相结合的综合防控措施[4]。 猪二号菌苗对于牛的布鲁菌病用法为饮服、喂服和注射，对牛的免疫期为1 年；而对于牛新孢子虫病的感染特效药、疫苗仍在研究阶段。 对此两种病的预防应做到以下几点：(1) 通过网格化逐步筛查对检测为阳性牛进行淘汰或隔离饲养，政府可通过病牛换健康牛鼓励畜主参与，对自愿淘汰或在规定低屠宰的政府给予相应的补偿，降低畜主经济损失[5]；(2) 对受污染的场地、草滩、用具、饲草等彻底消毒，防治疫病蔓延；(3)布鲁菌病阳性牛只屠宰淘汰。 肉品及其他附属产品彻底煮熟后再进行焚烧、深埋等无害化处理，受污染的环境及用具彻底消毒，工作人员在处理时要做好防护措施；(4)对无法扑杀的病畜，落实病畜隔离，应固定场地、用具，指定专人喂养，加强饲养管理，进行药物治疗，促进其康复自愈；连续两次检疫转阴后可以解除隔离。 另外，可督促畜主及时上报空胎、流产、产死胎、弱胎的牲畜，以防发生新病源在畜群间蔓延。也可利用电视、广播、宣传册等手段宣传布病及新孢子虫病防控知识，提高广大养殖农户对该病的防范意识和自我保护意识。 同时，相关工作单位应加强对养殖户及技术人员的技术培训，以达到提高防控疾病的能力和业务水平。