苏丹红I 对大鼠CYP1 A1、CYP2 E1 和CYP3 A1基因表达及ALT 和AST 活性的影响

单春兰， 刘超英， 孙文汇， 富国文， 严玉霖， 高 洪

(1. 云南农业大学动物科技学院， 云南 昆明 650201 ；2. 云南农业大学动物医学院， 云南 昆明 650201)

Sudan I 是人工合成的亲脂性偶氮化合物，常用作工业染料。 Sudan I 可通过多种途径进入生物体内，通过胃肠道微生物还原酶、肝脏及肝外组织微粒体和细胞质的细胞色素还原酶系(如细胞色素P450s)等进行代谢[1]。 体内能够代谢成相应的胺类物质，可渗透机体血红细胞，对许多器官和组织造成损伤，对机体具有致癌、致突变、致氧化损伤、皮肤过敏等毒性作用。 细胞色素P450s，是一种广泛存在于生物体内含亚铁血红素的超家族蛋白酶，主要有CYP1、CYP2、CYP3 三个基因家族，是生物体内参与内源性化合物(激素、脂肪酸)和外源性化合物(药物、前致癌物)生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切相关。 丙氨酸氨基转移酶(ALT)在肝脏组织中含量最为丰富，主要存在于肝细胞的胞浆内，机体受损时可由肝细胞释放入血液中，使血清中的这种酶活性升高。天冬氨酸氨基转移酶(AST)主要存在于心肌中，但肝脏中含量也非常高，在肝细胞中，线粒体存在80%，包浆中存在20%。 ALT 和AST 均为非特异性细胞内功能酶，正常机体血清含量很低，当肝细胞受损时，肝细胞膜通透性增加，胞浆内的ALT、AST 释放入血浆，致使血清ALT、AST 的活性升高[2]。

本试验拟用空白对照组、Sudan I 处理组实验动物SD 大鼠，建立肝脏病理性损伤的中毒动物模型，采用半定量RT-PCR 技术和酶成分分析探讨CYP450 酶系基因表达以及ALT 和AST 的变化，对认识Sudan I 致肝损伤机理以及建立Sudan I 中毒病理性评价标准等方面提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 苏丹红I (Sudan I )，购自国药集团化学试剂有限公司；TRIZol 试剂、DEPC、 RT-PCR 试剂盒、SYBR-Green Supermix(BIO-RAD)，购自北京全式金生物技术有限公司；DL-2000 Marker，购自云科生物有限公司；Gold view (生物核酸染料)，购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要仪器 DANGERSJ-CJ-1F 型超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；Beckman 超速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；UV755B 紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)； Eppendorf PCR仪(德国Eppendorf 公司)；荧光PCR 仪(美国Bio-Rad公司)；DYCP-31BN 电泳槽(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad 公司)；FA1004N 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3 实验动物分组与处理 30 只清洁级SD 大鼠，体重140 ～160 g/只，雌(无孕)雄不拘，由昆明医学院实验动物科提供。 临床检查确认健康后，单笼、颗粒饲料预饲养3 d，自由饮水采食，编号并随机分为空白对照组(C 组)和Sudan I 处理组(I ， II， III和IV 组)，每组6 只。

将Sudan I 与饲料按一定比例充分混匀配制成颗粒饲料，分别以4 个不同剂量饲喂Sudan I 处理组：I 组(265 mg/kg·bw)、II 组(530 mg/kg·bw)、III 组(795 mg/kg·bw)和IV 组(975 mg/kg·bw)，连续饲喂10 d。 C 组饲以普通颗粒饲料，饲喂与处理组相同天数。

1.4 肝脏样品的采集 末次给药后，大鼠禁食12 h，处死大鼠后立即剖腹，用已干热灭菌的镊子、剪刀剪取150 mg 左右的肝脏分别装入无菌的冻存管中，拧紧瓶盖后立即放入液氮中速冻。 然后转入-80 ℃的超低温冰箱中冷冻保存备用。

1.5 半定量PCR 检测CYP 亚酶mRNA 的相对表达 本研究以CYC 为内参对照，检测大鼠肝脏组织中CYP 主要亚型CYP 1A1，CYP 2E1，CYP 3A1 mRNA 表达相对量。 方法为取大鼠肝脏组织30 mg，液氮研磨组织块，按常规TRIZol 法提取总RNA。 在核酸定量仪nanodrop 下测定吸光度OD 值，计算RNA 的浓度，RNA 的浓度(μg/μL) =OD260×OD500(核酸稀释倍数) × (40/1 000)μg/μL。 以总RNA为模板，按照北京全式金生物技术有限公司cDNA试剂盒说明书逆转录合成cDNA。 半定量RT-PCR 反应加入2 μL cDNA，20 μL 反应体系是10 μL IQ SYBR Green Supermix、正、反义引物各0.5 μL、1.5 μL 的cDNA 摸板，补去离子水至20 μL。 反应条件：预变性94 ℃，3.5 min； 变性94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共40 个循环；最后72 ℃，延伸10 min。用2-ΔΔCt 法计算实验组与对照组各基因的相对表达量[3-4]。 半定量RT-PCR 扩增引物参照文献[5]设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。

表1 引物及扩增片段长度

1.6 血液样品的采集 分别按照实验设定的剂量处理后处死大鼠，摘眼球采集2 mL 血液制备血清，用于ALT 和AST 检测。

1.7 统计学分析 采用SPSS 统计软件19.0 进行单因素方差分析( ANOVA) 和最小显著差法(LSD)进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 半定量分析CYP 1A1、CYP2 E1 和CYP 3A1基因的表达 CYP 1A1、CYP 2E1 和CYP 3A1 基因相对表达量结果，见表2。

从表2 可以看出，半定量RT-PCR 检测到在C、I ，II， III 组和IV 组CYP 1A1 基因相对表达量分别为1.28、1.71、2.03、2.20 和2.08，表明不同的Sudan I处理组显著高于C 组(P ＜0.05，P ＜0.01)；在C、I ， II， III 组和IV 组CYP 2E1 基因表达量分别为1.13、1.16、1.55、1.49 和1.31，表明Sudan I 不同处理组显著高于C 组(P ＜0.05，P ＜0.01)；在C、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和Ⅳ组基因表达量分别为1.08、1.29、1.31、1.41 和1.40。 t 检验结果表明，Sudan I 不同处理组显著高于C 组(P ＜0.05，P ＜0.01)。 在一定剂量范围内，CYP 1A1，CYP 2E1 和CYP 3A1 基因的表达量均随剂量上升而增加。

表2 大鼠肝脏CYP 1A1、CYP 2E1 和CYP 3A1_____________________基因表达量

2.2 CYP1A1、CYP2E1 和CYP3A1 基因的RT-PCR扩增图 目的基因RT-PCR 电泳产物扩增结果见图1。

图1 目的基因RT-PCR 电泳产物扩增结果

从图3 可以看出，显示与预期相符，良好的、无拖尾的目的基因条带。

2.3 ALT、AST 活性的变化情况 大鼠血清中ALT、AST 活性的测定结果见表3。

从表3 可以看出，本试验结果显示，ALT 活性在C、I ， II， III 组和IV 组分别为48、70、75、97 和137。t 检验结果表明，Sudan I 处理组显著高于C 组(P ＜0.05，P ＜0.01)。 AST 活性在C、I ， II， III 组和IV组分别为106、155、198、409 和938。 t 检验结果表明，Sudan I 处理组显著高于C 组(P ＜0.05，P ＜0.01)。 且在一定范围内，随着Sudan I 剂量的增加，ALT、AST 活性有明显升高的趋势。

表3 Sudan I 对大鼠血清中ALT、AST 活性的变化

3 讨论

3.1 苏丹红I 对CYP1A1 基因表达的影响 CYP 1A1 可以将外源物质转变为亲电子化合物，该亲电子化合物可攻击细胞内的生物大分子，与DNA 或蛋白质形成加合物，最终引起P450 酶系所在的靶器官肝脏发生损伤[6]。 有研究发现，CYP 1A1 在许多癌症发病学中发挥着一定作用，CYP 1A1 表达水平被认为是化学致癌作用的一种潜在指标。 CYP 1A1活性只有在某些诱导剂，如二噁英、多环芳烃、多氯联苯等诱导后表达水平较高，其诱导机制与芳香烃受体有关，芳香烃受体可高度诱导增加CYP 1A1 基因的表达而增加CYP 1A1 的活性，生成环氧化合物攻击大分子物质，导致肝脏的损伤[7]。

本研究通过半定量RT-PCR 法分析CYP 1A1基因表达情况结果显示，CYP 1A1 基因在C 组和Sudan I 处理组均有表达，且二组定量方法的检验结果一致，均表明不同的SudanⅠ处理组显著高于C组，且在一定剂量范围内表现为上升趋势。 但是在Ⅳ组表现为下降，分析认为机体本身是一个复杂的大系统，肝损伤时代谢调控可能发生了变化。 王婷等[9]将怀孕大鼠暴露于烟雾中，提取肝脏和胎盘总RNA，半定量RT-PCR 法分析肝脏和胎盘CYP 1A1基因的表达变化。 结果显示，肝脏CYP 1A1 基因表达和胎盘CYP 1A1 基因表达均高于正常C 组，表明香烟中所含多环芳烃类物质及尼古丁等有毒物质增加对机体肝脏的损伤。 可见在代谢外源毒物过程中，CYP 1A1 处于重要位置。

3.2 苏丹红I 对CYP 2E1 基因表达的影响 CYP2家族细胞色素CYP 2E1 在体内负责6 大类、70 余种低分子化学物质的代谢，包括苯胺、乙醇、丙酮、氨基甲酸乙酯以及亚硝胺类化合物等[10]。 有些外源毒物可经CYP 2E1 代谢，代谢生成肝毒性的活性中间产物，导致了肝细胞的基因表达，启动膜的脂质过氧化，导致胞内外的Ca2+浓度平衡状态发生改变，破坏机体重要的抗氧化物质谷胱甘肽，从而引起肝脏细胞的损伤[11]。 采用半定量PCR 法分析CYP 2E1 基因的表达情况结果显示，CYP 2E1 基因在C 组和Sudan I 处理组均有表达，Sudan I 不同处理组显著高于C 组，且在一定剂量范围内CYP 2E1基因的表达呈现为上升趋势。 但在Ⅲ组表现为下降，分析认为机体本身是一个复杂的大系统，肝损伤时代谢调控可能发生了变化。 王爱红等[12]将氯乙烯染毒大鼠，观察肝CYP 2E1 活力和基因表达的影响，发现随着氯乙烯染毒剂量的增加，大鼠肝脏中CYP2E1 活性和基因表达量也随之增加，结果显示了氯乙烯促使CYP2 E1 基因表达的增加，导致了肝细胞的基因表达，启动膜的脂质过氧化，导致胞内外的Ca2+浓度平衡状态发生改变，破坏机体重要的抗氧化物质谷胱甘肽，从而引起肝脏细胞的损伤。

3.3 苏丹红I 对CYP 3A1 基因表达的影响 CYP 3A1 是CY P450 基因家族中最重要的代谢酶基因，其在许多毒理学和药物代谢方面具有重要意义[13]。CYP 3A1 在药物代谢、环境中有害物质的代谢及内源性类固醇激素的代谢中，它是一种重要的单氧化酶，它能被多种化合物所诱导，也能被多种化合物所抑制。 这种酶的活性影响着外源物的血液浓度、代谢过程，从而对外源物的安全性和毒副作用产生影响。 有报道发现，如果CYP 3A1 活性被诱导增加，可导致生殖系统的毒性作用[14]。 采用半定量RT-PCR 法分析CYP 3A1 基因表达量情况，t 检验结果表明，Sudan I 不同处理组显著高于C 组，且在一定剂量范围内CYP 3A1 基因的表达呈现为上升趋势。 但在Ⅳ组表现略有下降，分析认为机体本身是一个复杂的大系统，肝损伤时代谢调控可能发生了变化。 由此可见，CYP 3A1 诱导作用影响了Sudan I在血液浓度的代谢速度，对机体产生了影响，而发挥Sudan I 的毒性效应。

3.4 苏丹红Ⅰ对ALT 和AST 活性的影响 ALT、AST 是反映肝脏损伤的最重要的生化指标，ALT 在肝脏组织中含量最丰富，损伤时可由肝细胞释放入血液中，使血清中的这种酶活性升高。 AST 主要存在于心肌中，但肝脏中含量也非常高，当肝细胞受损时，肝细胞膜通透性增加，胞浆内的ALT、AST 释放入血浆，致使血清ALT、AST 的活性升高。

本试验结果表明，Sudan I 处理组ALT、AST 活性显著高于C 组，且随着剂量的增加，两者活性有明显升高的趋势。 谷长勤等[15]在黄曲霉毒素导致雏鸭中毒肝损伤的实验报道中采用测定血清AST、ALT 水平来探讨黄曲霉毒素对雏鸭中毒损伤程度。同样本试验也采用测定血清AST、Sudan I 对大鼠肝脏细胞损伤的程度。 通过结果，我们可以分析出当Sudan I 进入机体后，随血液入肝脏后，致胞浆内转氨酶释放，故血清ALT 水平明显升高，随着时间的增加，肝细胞病变加剧，大量的肝细胞使线粒体内结合的AST 释放，故血清内AST 活性也明显升高，因而导致了机体肝脏损伤。