不同浓度盐碱胁迫对异育银鲫的慢性损伤效应

张 蕾， 郭曦尧， 马世宏， 程 义， 王建军， 楚冲之， 李月红

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林 长春 130118 ；2.内蒙古乌兰察布市兽医监察所， 内蒙古 乌兰察布 012000)

中国的西北、东北及华北等内陆地区有较多的高盐碱化湖泊、泡沼等水域，此类水域的水质具有高盐碱、高pH 值、离子系数高、离子比例失调等特点[1-2]。 水域盐碱浓度的变化与鱼类的生存及生长息息相关，普通淡水类鱼虾难以适应高盐碱水域环境，过高的盐碱浓度会对其机体造成不可逆的损伤。 盐碱度的变化可直接影响鱼类机体血液、血清各项生理生化指标变化或产生氧化应激反应，通过研究血液血清生理生化指标及抗氧化酶活性的变化对病理、生理学、毒理学或动物的临床诊断均有较大的意义。 近年来，盐碱水域养殖技术也已取得较大发展[3]，但有关盐碱度变化对水生生物机体胁迫所造成的损伤研究报道还较少。 因此，本文通过设置不同浓度梯度的盐碱联合胁迫试验，从而了解其对异育银鲫的慢性损伤效应，以期为进一步的研究提供相关数据参考。

1 材料与方法

1.1 化学试剂 碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)，购自天津市光复科技发展有限公司；试剂为分析纯(AR 级)，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒，均购自南京建成生物工程有限公司。

1.2 盐碱胁迫试验 试验异育银鲫120 尾，由长春市新立城水库提供。 饲养用水为充分曝气的自来水，水温维持在(25 ±2)℃，pH 值为7.3 ～7.5，氨氮含量为0.4 ～0.5 mg/L，保持供养泵24 h 开启，每缸水为60 L。 在2 周的驯化饲养后，随机选取健康、个体大小均匀的鲫鱼进行分组试验，为空白对照Ⅰ组和盐碱胁迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，设置NaCl 浓度梯度为1 mmol/L-1、2 mmol/L-1、3 mmol/L-1(分别称取3.51 g、7.01 g、10.52 g NaCl 溶于装有60 L 水的水族缸中)；NaHCO3浓度梯度为15 mmol/L-1、30 mmol/L-1、45 mmol/ L-1(分 别 称 取75.6 g、151.2 g、226.8 g NaHCO3溶于装有60 L 水的水族缸中)每组3 个重复，每个重复10 尾鱼。 试验期间盐碱胁迫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组水体pH 值分别为8.8±0.2、9.5 ±0.3、10.4 ±0.2；氨氮含量分别为0.7±0.1 mg/L、0.9±0.2 mg/L、1.2 ±0.1 mg/L。 试验为期6 周，期间每3 天定时换水，空白对照组换水量约为50%，盐碱胁迫组换水量约为70%。

1.3 样品处理 尾椎静脉取血方式采取各组鲫鱼血液，分装于无菌抗凝管及促凝管中，4 ℃暂时保存。 组织采集即在冰盘上剖检，收集组织，无菌生理盐水清洗后用滤纸吸干置于无菌EP 管中-80 ℃保存。

1.4 血液及血清生理生化指标测定 使用BayerDVIA 120 型血细胞分析仪进行指标的测定，测定指标包括白细胞总数、红细胞总数、红细胞压积、红细胞平均体积、血红蛋白、平均血红蛋白浓度、血小板。 使用贝克曼(ProCX4)全自动生化分析仪测定，测定指标包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)。

1.5 组织中抗氧化酶的测定 准确称取组织质量后按质量(g)∶体积(mL) =1∶9的比例加入9 倍体积的生理盐水，剪碎组织并在冰水浴条件下制备匀浆，2 500 ～3 000 r/min 离心10 min，吸取上清待用。SOD 及CAT 活性测定的具体操作均按南京建成生物工程有限公司试剂盒说明书进行。

1.6 数据处理及分析 存活率=存活尾数/总尾数×100；增重率=(Mt-Mo)/Mo ×100；Mt 为试验末鱼体质量，Mo 为试验初鱼体质量；试验所得数据均用平均值±标准误表示，采用IBM SPSS Statistics 20软件Tukey 单因素分析法进行统计分析。

2 结果

2.1 异育银鲫存活率及增重率 表1 为各组异育银鲫存活率及增重率结果。 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组增重率均显著低于Ⅰ组，其中Ⅳ组为负增重率。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组存活率均为100%，Ⅳ组存活率为70%。

表1 异育银鲫存活率及增重率

2.2 异育银鲫血液生理指标测定结果 下表2 为异育银鲫血液各生理指标的测定值。 相比于Ⅰ组，Ⅱ组白细胞及血小板数均显著提高(P ＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ组白细胞数显著降低(P ＜0.05)，Ⅲ组血小板数降低不显著(P ＞0.05)，Ⅳ组血小板数显著降低(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组红细胞平均体积均显著降低(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血红蛋白显著提高(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅳ组红细胞数显著提高(P ＜0.05)，Ⅲ组红细胞数提高不显著(P ＞0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组红细胞压积、平均血红蛋白浓度均显著提高(P ＜0.05)。

表2 异育银鲫血液生理指标测定值

2.3 异育银鲫血清生化指标测定结果 表3 为异育银鲫血清各生理指标的测定值。 相比于Ⅰ组，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组ALT、AST 活性均显著提高(P ＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组UREA、GLU、AKP、LDH、TP、ALB 水平均有不同程度提高，其中Ⅱ组UREA、GLU 水平差异不显著(P ＞0.05)；相比于Ⅰ组，Ⅱ组CREA 水平显著降低(P ＜0.05)，Ⅲ组CREA 水平降低不显著(P ＞0.05)，Ⅳ组CREA 水平显著提高(P ＜0.05)。

表3 异育银鲫血清生化指标测定值

2.4 异育银鲫肝胰脏SOD 及CAT 活性测定结果 各处理组异育银鲫肝胰脏SOD 及CAT 活性变化如下图1 所示，与对照组相比，Ⅱ组SOD及CAT 活性均显著升高(P ＜0. 05)，Ⅲ、Ⅳ组SOD 及CAT 活性均显著降低(P ＜0. 05)。

图1 肝胰脏SOD(左)及CAT(右)活性

3 讨论

3.1 对血液生理指标的影响 水体盐度可影响鱼类渗透调节功能，导致机体组织失水、代谢下降。碱度对鱼类的损伤效应属于综合致毒效应，碱浓度的变化主要导致鱼类产生应激反应，影响机体内环境的稳定性[4]。 通过测定血液生理指标的变化来评估鱼类机体的新陈代谢能力和生理健康水平已被广泛应用[5]。 本试验中，盐碱胁迫组异育银鲫红细胞数、红细胞压积、血红蛋白浓度及平均血红蛋白浓度均高于对照组，这可能是由于盐碱胁迫，机体做出的适应性反应从而产生应激反应。 张玉等[6]研究发现，盐碱水域鱼类机体与渗透压调节有关的白细胞、红细胞、红细胞压积等指标均显著高于淡水水域中的鱼类，与本试验结果相仿。 而白细胞数、血小板数随着水体盐碱浓度的升高表现为先升高后降低的趋势，表明高浓度的盐碱水环境对异育银鲫机体造成一定程度的损伤。

3.2 对血清生化指标的影响 血清生化指标的变化可从侧面反映鱼类机体新陈代谢的状况[7]。CREA 水平用于诊断肾功能状况，其水平的增高多见于各种原因而引起的肾小球滤过功能的减退。最高浓度盐碱胁迫组的CREA 水平显著升高表明异育银鲫肾功能受损。 与对照组相比，盐碱胁迫组血清GLU 水平均显著升高，其中Ⅲ、Ⅳ组与对照组差异性显著，表明异育银鲫组织细胞的代谢能力下降。 蛋白质作为血清中重要的组成成分，在鱼类生理和免疫系统中发挥着重要的作用，血清TP、ALB 主要参与维持机体内血浆胶体渗透压的稳定性，其中TP 还可维持血管内酸碱度的平衡[8]。 本试验中，盐碱胁迫组血清TP、ALB 水平均显著高于对照组，表明水体盐碱浓度的升高改变了机体渗透压，刺激机体提高ALB 水平。 血清UREA 含量的变化反应了动物体内蛋白质的代谢情况。 本试验中各处理组异育银鲫血清UREA 含量均高于对照组，其中高浓度的盐碱胁迫组与对照组差异显著，说明高浓度的盐碱胁迫对异育银鲫机体蛋白质的代谢有显著抑制作用。 ALT 和AST 是鱼类机体内重要的氨基转移酶，是氨基酸代谢中不可或缺的酶类，其活性的变化不仅反应鱼类氨基酸的代谢状况，而且也从侧面反应出鱼类肝功能的健康状况[9]。 本试验中，盐碱胁迫组血清ALT 及AST 活性均显著低于对照组，表明异育银鲫肝胰脏的代谢功能受到抑制。 LDH 水平的改变直接对机体的能量代谢产生影响，组织病变或受损可引起细胞膜的通透性增加，导致大量LDH 释放至血液中。 本试验中，不同浓度盐碱胁迫组异育银鲫血清LDH 水平显著高于对照组，表明其机体受到盐碱胁迫所导致的损伤作用。 AKP 参与动物体内营养物质的消化、吸收和运输，而且是动物解毒体系中重要的一部分。 本试验中，盐碱胁迫组AKP水平均显著高于对照组，表明盐碱胁迫对异育银鲫产生的毒性作用刺激机体AKP 水平的提高，从而缓解机体损伤。

3.3 对肝胰脏抗氧化酶活力指标的影响 活性氧自由基(ROS)为动物机体内的一种中间产物，其对维持基因调控、细胞增殖分化及其他生理调节起着不可或缺的作用。 盐碱胁迫会导致ROS 的生成量超过机体的负荷量，并累积于肝脏中，造成核酸损伤、蛋白质氧化、脂质过氧化[10]。 SOD 及CAT 作为抗氧化防御系统中的关键酶类，通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应或将机体内H2O2还原成水，来实现抗氧化防御减少机体损伤[11]。 王卓等[12]将耐盐碱能力较强的青海湖裸鲤暴露32 mmol/L-1和64 mmol/L-1的盐碱水中，结果发现7 d 内裸鲤肝胰脏SOD 活力表现为先升高后降低的趋势。 杨建[13]测定了10 d 内不同浓度盐碱暴露下大鳞鲃肝组织SOD 及CAT 活性变化，结果显示，其活性随着盐碱暴露浓度升高及时间的延长呈现先升高后降低的趋势。 本试验也得到相同的结果，相比于对照组，盐碱胁迫Ⅱ组SOD 及CAT 活性显著升高，Ⅲ、Ⅳ组均显著降低。 表明低浓度的盐碱胁迫可促使异育银鲫机体产生反馈抵抗机制以应对应激反应，随着盐碱浓度升高，抗氧化酶活性受到抑制，因而对机体造成了氧化损伤。