3 对中药对大肠杆菌O2 的联合抑制作用研究

王艳萍， 徐倩倩， 郭时金， 张 颖， 董 林， 杨丽梅， 马 力， 沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院， 山东 滨州 256600 ；2.山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东 滨州 256600 ；3.山东绿都安特动物药业有限公司， 山东 滨州 256600)

大肠杆菌感染可引起畜禽流行性大肠杆菌病，严重制约了养殖业的健康发展，与此同时，随着养殖规模的不断发展壮大，以及新旧动能转换趋势的发展，中兽药代替抗生素的趋势越来越迫切了。

中华医药博大精深，它是以整体观念和辩证论治为核心的独特医学科学体系，是中华民族优秀文化宝库中的一支奇葩。 中兽药是中兽医学防治畜禽疾病的重要手段，中兽药的配伍与禁忌是提高其临床疗效，保证用药安全的重要环节。 中兽医药因具备多种有效成分、无残留、多作用靶位、作用范围广、不易产生耐药性等优点而成为新型抗菌药物及抗菌药物增效剂的筛选靶点之一[1]。

为寻找抗鸡大肠杆菌的中兽药，本试验以黄连-紫花地丁、黄连-芦丁、黄连-双花连翘3 对中药对大肠杆菌的抑制为研究对象，通过微量棋盘法筛选最佳配比，以期达到合理用药、节约用药的目的，为中兽药发展做出奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药材 黄连、紫花地丁、芦荟，均购自安国伊康药业有限公司；双花连翘提取物，购自四川恒瑞通达生物科技有限公司；0.5 麦氏比浊管、MHB、MHA培养基等，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 菌株 大肠杆菌O2标准菌株由安徽农业大学基础兽医学教研室馈赠。

1.3 仪器 ST16R 离心机，美国ThermoFisher ST 16R；RE-52AAA 旋转蒸发器，上海嘉鹏科技有限公司；SH-B 95A 型循环水式多用真空泵，上海豫康科教仪器设备有限公司；台式小型离心机，Sigma 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 药物的提取及浓缩 称取30 g 黄连，粉碎，后加入10 倍、8 倍、8 倍水，煎煮提取3 次，每次2 h，3 000r/min 离心10 min，-0.1 Mpa 浓缩；称取20 g 紫花地丁，加入0.8 L 水冷凝回流煮沸1 h，再加入0.4 L 水冷凝回流煮沸1 h，3 000 r/min 离心10 min，-0.1 Mpa浓缩至1 g/mL；称取20 g 芦荟，加入40 mL水加热使溶解，3 000 r/min 离心10 min，-0.1 Mpa浓缩至0.5 g/mL。

1.4.2 制备大肠杆菌菌液 将大肠杆菌O2菌株，挑取平板上的单菌落，接种至肉汤培养基中，置37 ℃培养箱中，过夜培养，稀释至每毫升含细菌1.5 ×105CFU。

1.4.3 黄连、紫花地丁、芦荟和双花连翘最低抑菌浓度的检测 以微量稀释法(microdilution)进行：取U 形底96 孔板，在第1 -9 孔中每孔加入MH 肉汤50 μL，第1 孔加入药物原液50 μL，混合均匀后，依次倍比稀释至第9 孔，自第9 孔中吸取50 μL弃去。第10 孔加入MH 肉汤100 μL 作为空白对照，第11孔加入药物原液100 μL 作为药物对照，第12 孔为菌液对照(加入MH 肉汤50 μL)；在第1 孔至9 孔和12 孔各加入以上制备好的菌液50 μL；加完液后盖上盖，振荡混匀，置入垫有湿润纱布的方形盘内，于36 ℃培养18 h ～24 h 后，观察结果。1.4.4 黄连-紫花地丁、黄连-芦荟、黄连-双花连翘联合抑菌效果的测定 微量棋盘稀释法，基本方法同微量稀释法。 用灭菌后的96 孔微孔板，在第1 ～6 行沿X 轴方向(从左到右)每孔中依次加入：MHB，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC 的黄连药液各25 μL，以同样的方法在第A-F 列沿Y 轴方向(从上到下) 每孔中依次加入8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC 的紫花地丁(芦荟或双花连翘提取物)提取物液、MHB 各25 μL，将两药混合均匀。 然后加入制备好的菌液50 μL，使最终抗菌药物浓度与计划稀释度相同，加液完毕，盖上盖，振荡混匀，放入垫有湿纱布的方盘内，36 ℃培养18 h ～24 h，观察结果。 棋盘稀释法药物加入方法按表2，并设立平行样。 两种药物组合后每孔的最终浓度则为原药物浓度的1/4。 加液完毕后放入36.5 ℃培养箱，培养18 h。

表1 微量稀释法药物加入方法

表2 棋盘稀释法药物加入法

1.4.5 结果判定标准 用消毒棉签将U 型底96孔聚乙烯微孔板的每孔培养物转移至MHA 平板，置于36.5 ℃培养箱，培养过夜，观察细菌生长情况。

2 结果

2.1 黄连、紫花地丁、芦荟、双花连翘提取结果 黄连、紫花地丁、芦荟、双花连翘的终浓度分别为1.0 g/mL、1.0 g/mL、0.5 g/mL 和10 g/mL。

2.2 最低抑菌浓度(MIC)

2.2.1 单独用药时黄连MIC 为(1/8 原液浓度)，紫花地丁MIC 为1/4 原液浓度，芦荟MIC 为原液浓度，双花连翘MIC 为1/4 原液浓度。

2.2.2 联合抑菌效果 黄连与紫花地丁联用时，黄连的MIC(联) =1/16 原液，紫花地丁联用时的MIC(联) =1/64 原液；黄连与芦荟联用时，黄连的MIC为1/128 原液，芦荟的MIC(联) =1/8 原液；黄连与双花连翘联用时，黄连的MIC 为1/64 原液，双花连翘(联)联用时的MIC(联)为1/16 原液。

2.2.3 联合抑菌FIC FIC(黄连-紫花地丁) =黄连联用时的MIC/黄连单测时的MIC+紫花地丁联用时的MIC/紫花地丁单用时的MIC =(1/16 原液)/(1/8 原液) +(1/64 原液)/(1/4 原液) =1/2+1/8 =0.625，0.5 ＜0.625 ＜1，二者表现为相加作用。

FIC(黄连- 芦荟) = 黄连联用时的MIC/黄连单测时的MIC+芦荟联用时的MIC/芦荟单用时的MIC= (1/128 原液)/(1/8 原液) + (1/8 原液)/(1/4 原液) =1/16 +1/2 =0.5625，0.5 ＜0.5625 ＜1，二者表现为相加作用。

FIC 黄连-双花连翘=黄连联用时的MIC/黄连单测时的MIC +双花连翘联用时的MIC/双花连翘单用时的MIC =(1/64 原液)/(1/8 原液) +(1/16 原液)/(1/4 原液) =1/8 +1/4 =0.375，0.375 ＜0.5，二者表现为协同作用。

3 结论

黄连与紫花地丁联用时表现为相加作用；黄连与芦荟联用时表现为相加作用；黄连与双花连翘提取物联用时表现为协同作用。

4 结果分析与讨论

由于中药成分复杂，不同中药提取物抗菌活性不同，作用机理不同于抗生素，疗效往往受中药各成分间的协同和综合作用影响[2-4]。

关于黄连与紫花地丁、黄连与芦荟、黄连与双花连翘这3 对中药对联合抑菌试验均未见相关报道。 由以上试验结果可知，黄连单独应用时，最低抑菌浓度为1/8 原液，紫花地丁单独用药时，抑菌浓度为1/4 原液，当二者联合应用时，黄连抑菌浓度降为单用时的1/2，紫花地丁抑菌浓度降为单用时的1/12，FIC=0.625，表现为相加作用；芦荟单用时的MIC 为原液，与黄连联用时，最低抑菌浓度为1/8 原液，降为原来的1/8，并且使黄连最低抑菌浓度降为原来的1/16，FIC =0.562 5，表现为相加作用；双花连翘单独应用时，最低抑菌浓度为1/4 原液，与黄连联合应用时，最低抑菌浓度降为原来的1/4，使黄连的抑菌浓度降为原来的1/8，FIC =0.375，表现为协同作用。

说明黄连与紫花地丁联合应用后，抑菌效果明显增强，目前尚未见到黄连和双花连翘提取物联合抑菌方面的报道，为黄连和紫花地丁的进一步研究奠定了基础。