巨噬细胞与肝癌转移及临床预后关系研究*

陈 霞，张国尊，刘莹莹，梁育飞，李春英，张秀刚，郑国启

河北省沧州市中心医院消化内一科(沧州 061001)

巨噬细胞与肝癌转移及临床预后关系研究*

陈 霞，张国尊，刘莹莹，梁育飞，李春英，张秀刚，郑国启

河北省沧州市中心医院消化内一科(沧州 061001)

*河北省沧州市科技局科技项目(162302166)

目的：研究巨噬细胞与肝癌转移及临床预后的关系。方法：收集行肝癌根治性切除术治疗的肝癌患者90例，采用免疫组化染色法检测组织中巨噬细胞的特异标志物CD68和VEGF的表达，与临床病理参数分析，并研究两者之间的相关性。结果：CD68与VEGF在肝癌组织中的表达显著高于正常肝脏组织(P<0.05)；C-D期肝癌组织中的CD68浸润程度显著高于A-B期肝癌组织(P<0.05)，存在淋巴转移的肝癌组织中的CD68浸润程度显著高于无淋巴转移的肝癌组织(P<0.05)；A-B期肝癌组织中VEGF的表达显著低于C-D期(P<0.05)，出现淋巴转移的肝癌组织VEGF的表达显著高于未出现淋巴转移者(P<0.05)；肝癌组织中VEGF的阳性表达与CD68的表达呈正相关关系(P<0.05)。结论：巨噬细胞的浸润程度和VEGF的表达水平都与肿瘤转移和临床分期有关，和VEGF表达呈正相关关系，CD68有望成为评估肝癌进展程度的重要指标，也为改善肝癌预后提供了新的靶点。

肝癌是常见的消化肿瘤之一，是病死率较高的三种疾病之一，严重威胁人类的生命健康。虽然医疗技术以突飞猛进的速度在发展，但肝癌的治疗仍是医学难题。肝癌预后较差的原因是因为其极易侵袭、转移。随着研究的不断深入，学者发现存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞在肝癌的发生、发展中起了重要作用，巨噬细胞参与上皮间质转化、促进血管生成参与肿瘤细胞的侵袭和转移[1]。研究证实，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)参与肿瘤细胞的发生、发展，在血管的生成过程中起重要作用。CD68是一种胞浆细胞系统，是巨噬细胞的标志物之一，本研究以CD68为巨噬细胞标志物，检测CD68和血管内皮生长因子在肝癌组织中的表达，以明确巨噬细胞在肝癌转移及预后的关系。

资料与方法

1 一般资料 回顾性收集2015年9月至2016年12月来我院行肝癌根治性切除术治疗的肝癌患者90例，均具有完整的临床资料，术前均未为采取任何手段的抗肿瘤治疗，术后检验病理标本证实为肝癌。90例肝癌患者中，男性57例，女性33例，年龄25～76岁，平均年龄(54.92±1.34)岁；AFP≥400μg/L41例，<400μg/L 49例；分化程度：低40例，高50例；肿瘤包膜完整者30例，无肿瘤包膜60例；肝癌巴塞罗那(BCLC)分期：A-B期51例，C-D期39例；淋巴结转移52例，无淋巴结转移38例；血管侵犯65例，无血管侵犯25例。本研究经我院伦理学批准，患者及家属知情同意。

2 研究方法

2.1 CD68的表达测定：采用免疫组化染色法，免疫组化试剂盒由北京中山金桥生物公司提供。甲醛固定肝癌标本，石蜡包埋，做成3μm厚的切片，请2位病理医师按照操作步骤观察、评分。随机选择10个高倍镜下的不同视野，统计胞浆内可见的棕黄色的颗粒所占的百分比，采取半定量标准[2]，<10%为阴性，≥10%为阳性。试验中阳性对照片由试剂公司提供，用 PBS替代第一抗体作阴性对照。

2.2 VEGF的表达测定：随机选择10个高倍镜下的不同视野，镜下计数100个细胞，根据染色强度和阳性细胞百分比采用半积分法判定结果，阳性细胞百分比：<5%为0分，≥5%且<25%为1分，≥25%且<50%为2分，≥50%且<75%为3分，≥75%为4分；染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，两项的乘积即为VEGF的表达结果。

结 果

1 CD68与VEGF在肝癌组织中的表达 研究结果显示，CD68在巨噬细胞的胞质和胞膜中呈灶状与片状分布，在血管周围集中，在肝癌组织中的表达率为94.44%(85/90)，VEGF染色为棕黄色和褐色，主要集中在细胞质，在肝癌组织中的表达率为96.67%(87/90)。CD68与VEGF在肝癌组织中的表达显著高于正常肝脏组织。

2 肝癌组织中CD68的表达与临床病理的关系 研究结果显示，C-D期肝癌组织中的CD68浸润程度显著高于A-B期肝癌组织(P<0.05)，存在淋巴转移的肝癌组织中的CD68浸润程度显著高于无淋巴转移的肝癌组织(P<0.05)，见表1。

表1 肝癌组织中CD68与VEGF表达与临床病理关系

3 肝癌组织中VEGF的表达与临床病理之间的关系 研究结果显示，A-B期肝癌组织中VEGF的表达显著低于C-D期(P<0.05)，出现淋巴转移的肝癌组织VEGF的表达显著高于未出现淋巴转移者(P<0.05)，见表2。

表2 肝癌组织中VEGF的表达与临床病理之间的关系

4 肝癌组织中CD68与VEGF表达的相关性分析 经Sperrman相关性分析，肝癌组织中VEGF的阳性表达与CD68的表达呈正相关关系(r=0.691，P<0.05)。

讨 论

肝癌又称肝细胞癌，是高发恶性肿瘤之一，而且预后差。全球每年死于肝癌的人数高达70万，而我国每年约37万人死于肝癌，占全球死亡人数的53%左右。虽然近年来医学诊断和治疗技术在不断提高，但是肝癌的病死率仍居高不下[3]。目前，最具临床诊断价值的肝癌标志物是甲胎蛋白(AFP)，据临床资料显示，其和肝癌的转移和预后有密切关系。研究证实，AFP诊断肝癌存在20%以上的假阳性或假阴性[4]，因此AFP对肝癌的评估价值有一定的争议。目前，寻找更可靠、更准确的诊断指标是肝癌研究领域的迫切任务，这对患者病情的有效诊断以及后期治疗有重要意义。

研究显示，肿瘤微环境对肿瘤的发生、发展起到了重要的促进作用[5]。而存在于肿瘤微环境中的肿瘤巨噬细胞通过影响介质的产生以及周围血管的生成来促进肿瘤的浸润和转移，其对肿瘤预后有重要意义，已成为众多学者研究的热点[6]。肿瘤的外周转移是肿瘤细胞不断繁殖、运动、粘附、侵袭、和宿主细胞相互作用的复杂、反复的过程，而到达微环境的单核细胞在微环境的刺激下发生不同性质的极化，其中替代性活化型巨噬细胞[7]导致宿主细胞免疫紊乱及免疫沉默，刺激肿瘤生长因子生成，诱导炎性反应[8]。Gouon-Evans等[9]通过乳腺癌小鼠模型发现，去除单核巨噬细胞，肿瘤转移受到抑制。CD68是巨噬细胞特异性较高的生物标记物，其参与组织的修复与重建，在促进血管生成、肿瘤的侵袭转移中起重要作用[10]。据陈利君等[11]报道显示，肝癌组织中的CD68数量和肝癌繁殖活性密切相关，有望成为肝癌预后的重要指标。

据相关资料显示，肿瘤组织中的巨噬细胞在肿瘤微环境的刺激下会被激活表达出一系列血管生长因子，内皮细胞生长因子(VEGF)是重要的一种[12]。巨噬细胞多聚集于厌氧环境，而肿瘤细胞的迅速生长需要消耗大量的氧气，必然导致局部细胞缺氧和供血不足，而缺氧环境可以刺激内皮细胞生长因子以及炎性因子的高表达，巨噬细胞聚集，引发肿瘤细胞血管的生长和繁殖[13]。血管供血是肿瘤细胞繁殖和转移的基础，研究证实，如果新生血管停止供血，那么肿瘤细胞将停止生长，而内皮细胞生长因子有非常强的促血管生成作用，其在促进肿瘤新生血管生成、肿瘤的浸润和转移中发挥着重要作用[14]。本研究通过回顾性收集90例肝癌患者的临床资料，研究了CD68和VEGF在肝癌组织中的表达以及两者的相关性，研究结果证实，CD68在巨噬细胞的胞质和胞膜中呈灶状与片状分布，在血管周围集中，在肝癌组织中的表达率为94.44%(85/90)，VEGF染色为棕黄色和褐色，主要集中在细胞质，在肝癌组织中的表达率为96.67%(87/90),CD68与VEGF在肝癌组织中的表达显著高于正常肝脏组织。90例肝癌患者中，处于A-B期的有51人，处于C-D期的有39人，出现淋巴转移的有52人，无淋巴转移的有38人，经检验结果显示，A-B期肝癌组织中CD68的表达、VEGF的阳性率显著低于C-D期；出现淋巴转移的肝癌组织中CD68的表达、VEGF的阳性率显著高于无淋巴转移者，可见，巨噬细胞的浸润程度和VEGF的表达水平都与肿瘤转移和临床分期有关，提示VEGF在肿瘤的发生、发展中起重要作用。而作为肿瘤微环境的重要组成部分，巨噬细胞通过多种途径参与肿瘤细胞的生长、侵袭以及转移，本研究中，肝癌组织中VEGF的阳性表达与CD68的表达呈正相关关系，可见，巨噬细胞是通过促进VEGF的表达而促进肿瘤细胞的生长和侵袭[15]。

综上所述，巨噬细胞的浸润程度和VEGF的表达水平都与肿瘤转移和临床分期有关，和VEGF表达呈正相关关系，CD68有望成为评估肝癌进展程度的重要指标，也为改善肝癌预后提供了新的靶点。

[1] Franco LH, Fleuri AKA, Pellison NAC,etal. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptors signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to leishmania major infection [J]. 2017, 11(32):13087-13096.

[2] Sun S, Zhang M, Yang Q,etal. Resveratrol suppresses lipoprotein-associated phospholipase A2 expression by reducing oxidative stress in macrophages and animal models [J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2017, 13(7):1613-4125.

[3] 束 平, 秦 净, 秦新裕, 等.巨噬细胞分泌的可溶性因子诱导HepG2细胞发生上皮间质化[J].中华肝胆外科杂志, 2013, 19(5): 378-381.

[4] Yang K, Liu X, Liu Y,etal. DC-SIGN and Toll-like receptor 4 mediate oxidized low-density lipoprotein-induced inflammatory responses in macrophages [J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 3296.

[5] 李 焱, 陈 石, 魏 东, 等.巨噬细胞对肝癌细胞株侵袭能力的影响[J].西南国防医药,2014, 24(12): 1309-1310.

[6] 刘立国, 杨志英.肿瘤微环境中巨噬细胞及相关细胞因子对肝癌切除术后患者预后的影响[J].癌症进展, 2016, 14(1): 29-31.

[7] 潘晶晶, 葛勇胜,许戈良,等.M2型巨噬细胞在肝癌的表达意义及与p-STAT3、STAT3的关系[J].安徽医科大学学报, 2013, 48(10): 1147-1151.

[8] 缪俊俊, 李国利, 贾筱琴.肿瘤相关巨噬细胞在肝癌中的研究进展[J].肿瘤预防与治疗,2014,27(4): 204-208.

[9] Iyengar P, CRTCTP, Shah S J,etal. Adipocyte-secreted factors synergistically promote mammary tumorigenesis through induction of anti-apoptotic transcriptional programs and proto-oncogene stabilization [J]. Oncogene, 2003, 22(41): 6408-6423.

[10] 葛勇胜, 许戈良, 刘维峰.肿瘤相关巨噬细胞与肝癌的研究进展[J].国际外科学杂志, 2012, 39(4): 260-263.

[11] 陈利君, 陈静琦, 曾波航.肝癌组织中CD68+肿瘤相关巨噬细胞数量与Ki-67蛋白表达及原发性肝癌预后的关系[J].肿瘤防治研究, 2016, 43(9): 774-778.

[12] 徐 建, 王艳红, 沈沪佳.大鼠肝癌组织中巨噬细胞与细胞毒性T细胞关系[J].中华实验外科杂志, 2011, 28(11): 1877-1880.

[13] 詹棣华, 王 鲁.肿瘤相关巨噬细胞在肝癌中作用的研究进展[J].中华实验外科杂志, 2015, 32(10): 2615-2617.

[14] Zhang F, Xuan Y, Cui J,etal. Nicorandil modulated macrophages activation and polarization via NF-kappab signaling pathway [J]. Molecular Immunology, 2017, 88:69-78.

[15] 胡 鹏, 王卫星, 王 鹏, 等. 肿瘤相关巨噬细胞在肝癌组织中的表达及其与VEGF的相关性 [J]. 海南医学, 2016, 27(5): 689-691.

(收稿：2017-08-02)

Macrophagesrelationswithlivercancermetastasisandclinicalprognosis

Chen Xia,Zhang Guozun ,Liu Yingying,et al.

Cangzhou Central Hospital of Hebei Province(CangZhou 061001)

Objective: To study the relationship between macrophage and metastasis of liver cancer and clinical outcome. Methods: retrospectively collected radical resection of liver cancer treatment of the clinical data of 90 patients with liver cancer, using immunohistochemical staining method to detect macrophages in the tissues of the specific markers of CD68 and the expression of VEGF, and clinical pathological parameters analysis, and study the correlation between the two. Results: the expression of CD68 and VEGF in liver cancer tissue was significantly higher than normal liver tissue (P< 0.05); C-D cancer of the liver tissue of CD68 infiltration degree was significantly higher than A-B hepatocellular carcinoma tissue (P< 0.05), degree of lymphatic metastasis of liver cancer tissue of CD68 infiltration was significantly higher than without lymph node metastasis of liver cancer tissue (P< 0.05); A-B of VEGF expression in liver cancer tissue was significantly lower than phase C-D (P< 0.05), in lymphatic metastasis of liver cancer tissue expression of VEGF was significantly higher than without lymph node metastasis (P< 0.05); The positive expression of VEGF in liver cancer tissue was positively associated with the expression of CD68 (P< 0.05). Conclusion: macrophage infiltration degree and the expression of VEGF levels are associated with tumor metastasis and clinical stage, and VEGF expression is positively related to relationship, CD68 is expected to become an important index to evaluate the degree of liver cancer progress, also provide new targets for improving the prognosis of liver cancer.

Liver neoplasms/patholgy Macrophages Neoplasms metastasis Endothelial growth factors

肝肿瘤/病理学 巨噬细胞 肿瘤转移 内皮生长因子

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.005