氯硝柳胺抑制小胶质细胞炎症作用研究*

杨嘉颖,赵胤安,宋 欣,彭美琪，陈霜霜,贾 佳

苏州大学药学院(苏州215123)

·基础研究·

氯硝柳胺抑制小胶质细胞炎症作用研究*

杨嘉颖,赵胤安,宋 欣,彭美琪，陈霜霜,贾 佳∆

苏州大学药学院(苏州215123)

*国家自然科学基金资助项目(81371278)

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510285048Z)

∆通讯作者

目的：探讨氯硝柳胺对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞炎症作用的影响。方法：建立脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞系BV2炎症反应模型；采用Griess法检测细胞上清中NO释放量，MTT法检测细胞活性；实时定量 PCR (qPCR)检测促炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的表达量。分析氯硝柳胺对小胶质细胞炎症的影响。结果：氯硝柳胺能够显著抑制LPS激活的BV2细胞中NO释放量；qPCR 结果显示，与正常细胞组相比，LPS组BV2中促炎因子的表达水平明显升高；氯硝柳胺显著降低LPS诱导的BV2细胞中促炎因子表达。结论：氯硝柳胺对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应有明显抑制作用。

近年大量研究表明，中枢神经系统中的炎症损伤参与神经退行性疾病的发生与发展。异常激活的小胶质细胞在神经退行性疾病中发挥了重要作用。小胶质细胞异常激活后表现为促炎症状态，即M1表型，释放白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞促炎症因子介导神经炎症，造成脑组织功能和器质性损伤。氯硝柳胺(Nclosamide)，化学名5,2’-二氯-4’-硝基-水杨乙酰苯胺，该药物首次在1958年第六届国际热带医学与疟疾大会上首次被报导，之后用于多种疾病的治疗。研究显示，氯硝柳胺在许多疾病模型中具有抑制炎症的作用，如子宫内膜异位症模型[1]、类风湿性关节炎模型[2]等。然而，氯硝柳胺是否参与中枢神经系统的炎症反应目前未有报道。本研究以LPS诱导的小胶质细胞为炎症模型，探讨氯硝柳胺对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的影响。

材料与方法

1 材 料 DEME培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；青霉素/链霉素(Hyclone公司)；LPS及氯硝柳胺(美国 Sigma 公司)；MTT(碧云天生物科技有限公司)；RNAiso Plus，cDNA逆转录试剂盒及SYBR Green (宝生物工程有限公司)。

2 实验方法

2.1 BV-2细胞培养：含有10%胎牛血清以及1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。将培养皿置于温度为37 ℃以及一氧化氮含量为5%的环境下培养。细胞面积占据培养皿80%时可以被用来做实验。

2.2 NO含量测定：用Griess试验检测培养基中亚硝酸盐的浓度来评估NO的含量,根据NO溶于水后形成亚硝酸盐的原理。小胶质细胞在有或没有LPS(100 ng/ml, Sigma)刺激的情况下培养24 h。从4 ℃冰箱中取出A、B液，置于室温下平衡30 min。绘制亚硝酸盐的标准曲线。将待测样本上清加入96孔板中，设置3个复孔，每孔加入50μl样品。加入A液50μl，室温避光孵育10 min；之后加入B液50μl，避光孵育10 min，在30 min内利用酶标仪在550 nm波长处测量吸光率，利用标准曲线计算出亚硝酸盐含量。

2.3 MTT法测细胞活力：将状态良好的BV2细胞以1×104/孔的密度铺于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2环境中培养。弃孔内培养基，加入50μl质量浓度为0.5 mg/ml的MTT溶液，置于37 ℃、5%CO2环境下培养。2 h后，弃孔内液体，每孔加入500μl的DMSO，置于脱色摇床上低速震荡以使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪中检测570 nm条件下的吸光率，以此定量反映细胞的活性。

2.4 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)：收集BV-2细胞，用预冷PBS洗涤3次，加入1 ml Trizol，用移液枪轻轻混匀并吹下细胞至离心管，室温静置5 min，参照Takara公司Trizol试剂说明步骤提取BV-2细胞中的总RNA。用Nanodrop检测RNA的浓度，将浓度单位设定为ng/μl，取1 μg RNA用于逆转录，采用Takara公司生产的RT-PCR 反应试剂盒配置混合物，逆转录合成cDNA。将cDNA样品稀释，将引物、DEPC水和SYBR Green混合，配置混合液。96孔板划分对照组与实验组，设置三个复孔，每孔中加入1.5μl cDNA与8.5μl混合液，封膜，上机，在ABI StepOnePlus PCR 仪上进行实时荧光定量PCR检测。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s (×40 cycles)。以GAPDH为内参，引物序列见表1。

2.5 统计学方法：采用Sigma Scan统计学软件,计量资料以均数±标准差表示，两独立组间比较采用t检验，多组间用one-way ANOVA 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

表1 引物序列表

结 果

1 氯硝柳胺抑制LPS诱导的BV2细胞NO释放 LPS激活的小胶质细胞释放大量的NO参与中枢神经系统的炎症损伤，利用Griess法检测不同浓度氯硝柳胺处理LPS诱导的BV-2小胶质细胞24 h后，其细胞上清中NO的释放量。结果如图1所示：溶剂对照组中单纯用LPS诱导小胶质细胞NO释放量呈现多组中的最高值。实验组分为五组，氯硝柳胺浓度呈倍数递增，结果显示，NO的释放量在一定范围内呈现明显的浓度依赖性：当氯硝柳胺浓度为1.5256μM时，与对照组相比NO释放量降低不明显；当氯硝柳胺浓度为3.125～25μM时，NO释放量显著降低，呈浓度依赖性，且组间差异具有统计学意义；当氯硝柳胺浓度为50μM时，NO释放量与前一组氯硝柳胺浓度为12.5μM相比基本持平，与对照组相比，差异明显且结果具有统计学意义。该结果表明，氯硝柳胺能够抑制LPS诱导BV-2细胞NO的释放，并且氯硝柳胺的最适浓度在12.5～25μM之间。

2 氯硝柳胺对BV-2细胞活力的影响 为明确氯硝柳胺对LPS诱导BV-2细胞NO释放量的抑制作用不是由于其对细胞产生毒性作用所致，我们通过MTT法检测了化合物对LPS处理的BV-2细胞的细胞活力。结果如图2所示，与未加LPS组相比，浓度范围为1.5256～50μM氯硝柳胺作用于LPS诱导的BV-2细胞，对小胶质细胞的活力无显著影响。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图1 NO释放量测定图

图2 MTT细胞活力测定图

3 氯硝柳胺明显降低LPS诱导小胶质细胞促炎因子的表达 激活的小胶质细胞能释放大量炎症介质，如iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6等。为了探究氯硝柳胺是否有抑制炎症介质产生的作用，利用q-PCR技术，检测LPS诱导的小胶质细胞上清中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的mRNA表达量。结果如图3所示：未加入LPS处理时，对照组和单独给药处理组相关促炎因子mRNA表达水平很低，而给予LPS刺激后，iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的表达水平明显增高。氯硝柳胺(25μM)处理能明显抑制LPS诱导的小胶质细胞上清中这四种促炎因子的mRNA表达，且差异具有统计学意义。说明氯硝柳胺对LPS激活的BV-2细胞产生的炎症应答具有抑制作用。

与LPS组比较，*P<0.05,**P<0.01

讨 论

神经退行性病变是一类主要由于神经元死亡，突触丢失[3]导致的一系列神经系统疾病，例如阿尔兹海默症(Alzheimer disease, AD)、帕金森病(Parkinson disease, PD)、亨廷顿舞蹈症(HD)、肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等。疾病的主要病理表现为神经元的过度凋亡和(或)神经元结构与功能障碍。 根据目前研究进展，关于神经退行性疾病的发生和发展机制较多，例如自由基引起的氧化应激损伤、线粒体功能障碍、死亡受体途径和线粒体途径介导[4-5]的细胞凋亡[6]及炎症等。破坏的血脑屏障[7]、随循环系统入脑的外周免疫细胞与神经毒性因子、激活的胶质细胞[8]成为神经炎症的三个基本原因。神经炎症是脑部抵御神经元损伤以及感染性物质的重要防御机制[9]。

一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种非经典的神经递质，能够作为逆信使参与中枢神经系统中的信息传递[10]。脑组织中过量的一氧化氮具有神经毒性作用，能够诱导多种类型的神经元凋亡。过度激活的小胶质细胞产生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)与诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxidase，iNOS)，能够促使脑组织中的L-精氨酸转变为一氧化氮，增加谷氨酸的毒性损伤[11]。本研究发现，氯硝柳胺能显著抑制LPS诱导的小胶质细胞中iNOS mRNA的表达，说明其具有一定的神经保护作用。氯硝柳胺能够明显抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞NO的释放量：当氯硝柳胺浓度为3.125～25μM时，NO释放量显著降低且呈浓度依赖性。

小胶质细胞是中枢神经系统(Central nervous system，CNS)中含量最丰富的单核-巨噬细胞，约占细胞总数的10%。它的存在有利于维持神经元的稳态，并且在神经炎症过程中占有重要地位[12]。静息状态下的小胶质细胞呈分支状，其丰富的轴突与树突使其与星形胶质细胞，神经元以及血管之间建立联系，形成一张巨大的网络覆盖整个脑区，并对微环境的稳态起到一定得监视作用。一旦中枢神经系统受到损伤和(或)产生炎症反应，小胶质细胞迅速由分支状转变为阿米巴样，伸出伪足以覆盖更多区域，参与中枢神经系统的一系列病理生理过程[11]。小胶质细胞受LPS、IFN-γ等持续刺激异常激活后表现为促炎症状态，即M1表型，释放大量的炎症介质，诱导并加重神经元的损害以及导致神经退行性疾病。本研究发现未加入LPS处理时，对照组和单独给药处理组相关促炎因子mRNA表达水平很低，而给予LPS刺激后，iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的表达水平明显增高。而氯硝柳胺(25μM)处理能明显抑制LPS诱导的小胶质细胞上清中这四种促炎因子的mRNA表达，且差异具有统计学意义。说明氯硝柳胺对LPS诱导的小胶质细胞炎症因子的释放有一定抑制作用。然而，持续激活的细胞对中枢神经系统的损害有一定的保护以及修复作用，清除错构蛋白等。Shinjo R 等[13]研究发现在神经元华勒变性后，M1极化的小胶质细胞能够促进其轴索再生。在阿尔兹海默症模型中，M1极化的小胶质细胞有利于清除大脑中已经存在的淀粉样蛋白斑[14]。氯硝柳胺被证实对LPS诱导的小胶质细胞炎症因子的释放有一定抑制作用，由于只是初步进行体外实验，未能在动物模型上验证氯硝柳胺是否真正能够抑制神经炎症，以及药物作用是否是利大于弊仍然有待进一步实验研究。

同时氯硝柳胺是一种NF-κB抑制剂。NF-κB信号通路在神经退行性疾病中具有重要地位，它能够调节一系列炎症因子的产生，如:iNOS、TNF-α、IL-6、COX-2等[15]。最新研究显示，蜜环菌提取物作用于LPS诱导的小胶质细胞模型上，明显降低p56的磷酸化水平，阻断NF-κB信号通路，并且炎性介质表达均有所下调[16]。由此可见，NF-κB信号通路在小胶质细胞炎症模型中具有重要作用。而本实验发现氯硝柳胺(25μM)处理能明显抑制LPS诱导的小胶质细胞上清中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6的mRNA表达，且差异具有统计学意义。说明氯硝柳胺能显著抑制LPS诱导的小胶质细胞促炎因子的表达，提示NF-κB信号通路极有可能参与其中，这为我们下一步探讨氯硝柳胺在小胶质细胞参与的神经退行性疾病中的机制研究提供了一定思路。

作为一种驱虫药，氯硝柳胺的临床价值不断提高。研究显示，氯硝柳胺在许多动物模型中具有抑制炎症的作用。Genna R等将氯硝柳胺用于子宫内膜异位症的研究中，发现氯硝柳胺有抑制异常细胞增殖并且抑制炎症反应的作用，主要通过影响NF-κB与STAT3的激活[1]。Liang L等的研究显示，氯硝柳胺能够抑制TNF-α诱导的类风湿性关节炎的滑膜细胞导致的炎症作用，下调TNF-α、IL-1β、IL-6炎性细胞因子的表达，并且阻断TNF-α介导的IKK, IκBα的磷酸化[2]。我们的研究表明氯硝柳胺对LPS诱导的小胶质细胞炎症损伤有显著抑制作用，为下一步探索其参与中枢神经炎症作用和具体抗炎作用机制提供一定基础，同时有助于为神经退行性疾病提供新的治疗思路。

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(收稿：2017-04-18)

Anti-inflammatoryeffectsofNiclosamideinlipopolysaccharidestimulatedmicroglia

Yang Jiaying, Zhao Yin’an, Song Xin, et al.

College of Pharmaceutical Sciences, Suzhou University (Suzhou 215123)

Objective: To explore the inflammatory effects of Niclosamide in microglia stimulated by lipopolysaccharide. Methods: The effects of Niclosamide on inflammation were observed in BV-2 microglia stimulated by LPS. Nitric oxide production from microglia was assessed by measuring the nitrite concentration in the culture medium using Griess reagent. The cell viability was determined by MTT test. The production of pro-inflammatory factors containing inducible NO synthase(iNOS)，tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) and interleukin-6(IL-6)were examined by q-PCR. To analyze whether Niclosamide has effects on the inflammation of microglia. Results: Niclosamide significantly inhibited the release of NO from BV-2 microglia stimulated by LPS. qPCR results showed that Niclosamide remarkably decreased the mRNA expression of pro-inflammatory factors in activated BV-2 microglia induced by LPS.Conclusion: Niclosamid has an anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide stimulated microglia.

Inflammation Niclosamide/pharmacology Microglia Lipopolysaccharides

炎症 氯硝柳胺/药理学 神经小胶质细胞 脂多糖类

R967

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.001