幽门螺杆菌对胃癌前期阶段胃上皮DNA同源重组修复关键蛋白的影响

董海滨，米阳，黄煌，梅璐，何晓燕，李彦伟，郑鹏远

1.消化内科；2.病理科，郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450000

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一种主要定植在胃黏膜表面的革兰阴性菌[1]。世界上约有50%人口被H.pylori感染[2]，其传播方式主要是人与人之间的口口和粪口传播，有明显的家庭聚集现象[3]。各种流行病学显示，H.pylori感染是胃炎、胃十二肠溃疡、胃淋巴瘤和胃癌的主要病因[4]，并被WHO认为是一类致癌原[5]。既往研究表明，H.pylori主要作用于胃癌前期阶段，即胃上皮肠化及之前阶段，亦即H.pylori启动了胃癌的发生[6]。但是H.pylori感染引起胃癌发生发展的分子机制一直尚未阐明，其中H.pylori感染引起胃上皮DNA损伤及修复机制是近年来研究的热点[7]。DNA双链损伤主要通过两种方式修复，不精确的非同源重组(non-homologous end join，NHEJ)修复和精确的同源重组(homologous recombination，HR)修复[8]。研究表明，H.pylori感染可以导致胃上皮细胞DNA双链断裂，但却抑制很多DNA修复相关基因[9]。H.pylori感染细胞带着未经准确修复的DNA损伤，继续增殖分裂，进入了细胞恶变进程[10]。因此，阐明H.pylori抑制DNA修复，特别是HR精确修复的分子机制是急需探讨的重要问题，也是阐明胃癌癌前病变发生分子机制的重要方向。本研究中，我们将分析胃癌前期不同阶段H.pylori阳性与阴性患者胃黏膜上皮组织DNA损伤标志物及HR修复通路中关键蛋白的表达情况，探讨H.pylori在胃癌前期是通过哪些靶点抑制HR修复，揭示H.pylori在推动胃癌前期发展过程中的分子机制，从而为胃癌的早期诊断以及今后的精准治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1标本来源 郑州大学第五附属医院2017年3月-9月因消化道不适症状行胃镜检查患者165例，除外心脑血管疾病、肝肾功能衰竭、胃溃疡、胃部手术、大量吸烟饮酒史、H.pylori根除史、近2周用药史(抗生素、质子泵抑制剂、抗肿瘤药物等)。内镜下取胃窦病变部位胃黏膜上皮组织，制作蜡块。切片后行HE染色确定病理类型，其中慢性浅表性胃炎(CSG)80例、萎缩性胃炎(CAG)32例、肠上皮化生(IM)35例、不典型增生(Dys)18例。免疫组织化学方法确定H.pylori感染情况，其中H.pylori阳性患者78例，平均年龄(54.1±13.4)岁；H.pylori阴性患者87例，平均年龄(53.9±13.6)岁。所有患者均知情同意。

1.1.2实验试剂 γH2AX抗体来自德国柏林马克思普朗克感染生物学研究所Thomas F. Meyer教授馈赠，鼠抗MRE11多克隆抗体(ab214)购自美国Abcam公司，鼠抗Rad51多克隆抗体(MA5-14419)、兔抗CtIP多克隆抗体(PA5-20963)购自美国Thermo Fisher公司，兔抗H.pylori多克隆抗体(ZA-0127)、兔二抗试剂盒(SP-9001)、鼠二抗试剂盒(SP-9002)、DAB显色剂均购自北京中杉金桥，PBS粉剂、柠檬酸钠抗原修复液等均购自北京雷根公司。

1.1.3实验仪器 BMJ-B型包埋冷台、PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)，LEICA RM2245组织切片机。

1.2方法

1.2.1组织切片 用切片机切取厚度为3 μm切片，捞片后摊片5 min，后置于烘片机内70℃烘烤1 h，留作备用。

1.2.2免疫组织化学 将上述制备好切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脱蜡各15 min，后置于无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脱苯各10 min，再置于95%、85%、75%梯度酒精水化各5 min，PBS清洗3次。柠檬酸钠抗原修复液微波修复15 min，冷却至室温，PBS清洗3次。3%过氧化氢去离子水封闭内源性过氧化物酶15 min，PBS清洗3次，山羊血清封闭15 min，倾去，滴加一抗，4℃孵育过夜。次日取出，PBS清洗3次。滴加生物素化二抗37℃孵育20 min，PBS清洗3次。再滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20 min，PBS清洗3次。DAB显色剂显色5 min，蒸馏水终止反应。流水清洗15 min，苏木素复染胞核5 min，自来水充分清洗。盐酸酒精分化5 s，流水冲洗15 min。依次置于75%、85%、95%乙醇和无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脱水各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min，中性树胶封片观察。空白对照组使用相同抗体稀释液孵育过夜。

1.2.3病理结果判定与免疫组化评分 病理切片由两名经验丰富病理医生读片，结果根据悉尼标准进行判定[11]。H.pylori免疫组化在胃黏膜上皮或腺管内观察到小短杆状、黄褐色螺旋样菌即为H.pylori阳性，反之为阴性。免疫组化评分采用德国半定量方法[12]，两名病理科医生双盲评分平均而得。γH2AX、MRE11、Rad51、CtIP蛋白表达以胃黏膜腺管上皮细胞核呈黄至棕褐色为阳性细胞，无着色为阴性细胞。阳性细胞数评分标准：(1)阳性腺管上皮细胞数占总腺管上皮细胞数的百分比：<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；≥75%为4分。(2)染色强度以视野中多数细胞所呈现的染色深浅计分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(3)组织得分为阳性细胞所占比例计分和染色计分乘积，再根据以下判定结果统计阳性表达例数进行相关性分析：0～2分阴性(-)，3～5分弱阳性(+)，6～8分中度阳性(++)，9～12分强阳性(+++)。

1.3统计分析 所得数据采用SPSS 20.0软件进行

统计学分析，等级资料多组间采用Kruskal-WallisH检验，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DNA损伤标记蛋白和HR修复关键蛋白在胃癌前期不同阶段的分布和差异 DNA损伤标记蛋白(γH2AX)和HR修复关键蛋白(MRE11、Rad51、CtIP)在胃黏膜组织腺管上皮细胞内的表达，以及H.pylori在胃黏膜腺管内的分布如图1所示。4种蛋白在胃癌前期不同病理阶段的表达差异无统计学意义。

图1 免疫组化检测H.pylori及DNA损伤标记蛋白和HR修复关键蛋白的表达(×400)

2.2H.pylori在胃癌前期不同阶段对DNA损伤标记蛋白和HR修复关键蛋白表达的影响 为进一步明确H.pylori感染在胃癌前期不同病理阶段对DNA损伤标记蛋白和HR修复关键蛋白表达的影响，我们进一步进行统计分析。

2.2.1H.pylori对γH2AX表达的影响 在CSG、CAG、IM三组内，γH2AX的表达H.pylori阳性组高于阴性组，差异有统计学意义(Mann-WhitneyU=1116.5，P=0.001；Mann-WhitneyU=185.0，P=0.018；Mann-WhitneyU=214.5，P=0.041)；而在Dys组内，H.pylori阳性与阴性亚组表达差异无统计学意义(Mann-WhitneyU=35.5，P=0.964)。见表1。

表1 H.pylori与γH2AX表达

注：CSG:慢性浅表性胃炎，CAG:慢性萎缩性胃炎，IM:肠上皮化生，Dys:异性增生。

2.2.2H.pylori对MRE11表达的影响 在CSG、CAG两组内，MRE11表达在H.pylori阳性亚组高于阴性亚组，差异具有统计学意义(Mann-WhitneyU=1117.0，P=0.001；Mann-WhitneyU=201.0，P=0.002)；而在IM、Dys两组内，H.pylori阳性与阴性亚组内表达差异无统计学意义(Mann-WhitneyU=171.0，P=0.568；Mann-WhitneyU=41.5，P=0.616)。见表2。

表2 H.pylori与MRE11表达

注：CSG:慢性浅表性胃炎，CAG:慢性萎缩性胃炎，IM:肠上皮化生，Dys:异性增生。

2.2.3H.pylori对Rad51表达的影响 在CSG、IM两组内，Rad51表达在H.pylori阳性亚组内表达低于阴性亚组，差异具有统计学意义(Mann-WhitneyU=490.0，P=0.002；Mann-WhitneyU=73.0，P=0.007)；而在CAG、Dys两组内，H.pylori阳性与阴性亚组内表达差异无统计学意义(Mann-WhitneyU=101.0，P=0.404；Mann-WhitneyU=24.0，P=0.291)。见表3。

表3 H.pylori与Rad51表达

注：CSG:慢性浅表性胃炎，CAG:慢性萎缩性胃炎，IM:肠上皮化生，Dys:异性增生。

2.2.4H.pylori对CtIP表达的影响 在CSG、IM两组内，CtIP表达在H.pylori阳性亚组表达低于阴性亚组，差异具有统计学意义(Mann-WhitneyU=593.0，P=0.044；Mann-WhitneyU=58.5，P=0.001)；而在CAG、Dys两组内，H.pylori阳性与阴性亚组内表达差异无统计学意义(Mann-WhitneyU=84.0，P=0.136；Mann-WhitneyU=18.5，P=0.102)。见表4。

表4 H.pylori与CtIP表达

注：CSG:慢性浅表性胃炎，CAG:慢性萎缩性胃炎，IM:肠上皮化生，Dys:异性增生。

3 讨 论

3.1国内外研究进展 DNA损伤导致的基因组不稳定性增加是癌症发生发展的重要分子机制。DNA双链断裂是DNA损伤最严重的一种形式，可以导致基因缺失突变，甚至染色体重排异位等严重后果[13]。NHEJ和HR修复是DNA双链断裂时最主要的修复方式。其中NHEJ修复是不精确修复，而HR修复是高保真的精确修复。在细胞进入S/G2期，MRE11和CtIP在HR修复早期剪切DNA断裂末端，从而和CtIP一起以5′→3′端核酸内切酶来剪切DNA断端，从而也去掉了结合在DNA断裂末端的Ku70/80，抑制了NHEJ修复，开启了HR修复模式。剪切形成的DNA断裂端悬臂被RPA结合，然后RPA被DNA重组酶Rad51取代，形成延长的DNA单链螺旋丝状体，被称为突触前复合体。继而用来配对同源DNA，为后继精确修复提供模板，开启了HR修复[14]。因此，MRE11、CtIP开启了HR修复通路，而Rad51处于HR修复的核心地位，三个蛋白是HR修复通路的核心蛋白。γH2AX由DSB断点附近组蛋白H2AX磷酸化而来，通过标注DSB附近的核小体作为DNA损伤的分子标记[15]。

以往在H.pylori感染细胞系模型中的研究表明，H.pylori感染可以抑制大部分DNA修复蛋白相关基因，包括某些HR修复蛋白的基因[9]。但对临床H.pylori感染的患者胃黏膜中DNA损伤修复蛋白的相关研究较少，或多局限于胃癌终末阶段胃上皮样本。现在主流研究认为，H.pylori主要作用于胃癌前期阶段，即肠化生阶段之前[6]。H.pylori感染启动了胃癌的发生。但对于H.pylori如何启动胃癌发生的分子机制至今未解。因此，研究H.pylori在胃癌前期阶段如何引起DNA损伤，以及如何抑制精确HR修复，就成了一个重要的研究方向。

3.2研究结果 本研究取自临床胃癌前期不同阶段患者胃黏膜标本，发现在CSG、CAG和IM阶段，H.pylori阳性组较阴性组γH2AX表达增多，从临床标本层面印证了H.pylori感染在胃腺癌前期导致胃黏膜细胞DNA双链断裂损伤。然后，进一步分析HR修复的核心蛋白，发现在多数胃腺癌前期病理类型中，MRE11的表达在H.pylori阳性组内高于阴性组，而Rad51和CtIP的表达H.pylori阳性组低于阴性组。由此可以推测，在临床胃黏膜样本中，H.pylori感染促进DSB损伤后，MRE11作为HR修复的起始蛋白，表达会增多。但是，另一个HR修复的起始蛋白CtIP表达降低。而且作为HR修复的核心蛋白Rad51也同时降低。从而势必影响HR修复开始阶段DNA断裂末端的剪切和后期DNA同源序列的寻找，影响HR修复的顺利进行。HR修复路径的功能障碍必将造成DNA修复错误率的增加，从而造成基因组的不稳定性增加。

3.3研究意义与创新 既往在体外细胞系和原代细胞感染模型中研究表明，H.pylori感染可以抑制大部分DNA修复基因，包括MRE11[9]，但是在我们此次体内临床样本研究中，却发现H.pylori阳性的慢性胃炎患者胃黏膜中MRE11表达相对H.pylori阴性的上调，说明在体内条件下可能有其他混杂因素参与调控MRE11。CtIP作为HR修复关键蛋白，既往未见有和H.pylori相关报道，此次是我们首次开创性的研究。我们发现在浅表性胃炎和肠化阶段，H.pylori阳性患者的胃黏膜标本中CtIP的表达较H.pylori阴性患者降低。CtIP作为HR修复重要起始蛋白和已知的抑癌蛋白[16]，其表达量的下降也将进一步增加了细胞的癌变风险，也揭示了H.pylori致癌机制的一个新靶点，值得我们进一步研究。因此，我们此次研究从临床标本层面证明，H.pylori可能是通过抑制CtIP和Rad51来抑制精确的HR修复路径，从而开启胃上皮细胞恶变的进程。

3.4不足与展望 当然，我们的研究也存在不足，比如样本量还不够丰富，这可能是没有观察到DNA损伤及修复蛋白在胃癌前期不同病理阶段有明显差别的原因，所以和以往某些相关研究有所差别。下一步，我们将增大样本量，并进一步分析H.pylori毒力菌株和毒力因子，以及相关的基因亚型与DNA损伤及HR修复蛋白的关系，探索H.pylori调控HR修复的具体机制，从而为临床胃癌个体化和早期诊断，靶向治疗提供理论基础。

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