渗透胁迫对云南松幼苗生物量及碳酸酐酶的影响

王晓丽，李文静，张志强，曾仰君，曹子林

(1.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224；2.昭通市林业有害生物监测检验中心，云南 昭通 657000；3.西南林业大学 环境科学与工程学院，云南 昆明 650224)

云南地处中国西南石漠化中心地区，是中国岩溶分布最广的省区之一。岩溶发育，往往导致土壤表层干旱缺水、土壤浅薄贫瘠(缺磷少氮)、岩石裸露、地形破碎、生态环境脆弱[1-4]，已成云南岩溶地区最大的生态环境问题。在岩溶区，根据基岩裸露率、坡度、土壤厚度、土被覆盖度、土被加植被盖度等因子，将石漠化划分为无明显石漠化、潜在石漠化、轻度石漠化、中度石漠化、重度石漠化、极度石漠化六个等级[5]。云南松(Pinusyunnanensis)林是我国西南地区特有的森林植被类型，同时也是云南省主要森林类型[6]，其天然林主要分布区的石漠化等级为无明显石漠化、潜在石漠化、轻度石漠化和中度石漠化，由此可见，云南松与岩溶生境具有协同适应性。

在岩溶地区，人们已经认识到植被对岩溶发育具有强大的驱动力。有报道认为碳酸酐酶(carbonic anhydrase,简称CA)对碳酸盐岩的溶解具有催化作用，在岩溶动力系统中加入CA可使石灰岩的溶解速率提高10倍[7-12]；云南松体内的CA在岩溶生境中具有良好的稳定性以及云南松体内CA活性与林内土壤中CA活性存在极显著的相关性[13-14]；硅藻[15]分泌的CA能促进石灰岩的溶蚀，因此，植物体内CA在生物岩溶发育过程中扮演着重要的角色。另外，研究发现CA在光合作用途径的碳固定中起着重要的作用，可加速无机碳向羧化酶活性部位的扩散，增加CO2的固定速率[16]；岩溶区玉米[17]叶片的CA活性和光合作用也高于非岩溶区；CA活性高低对植物水分利用及光合作用都有较大影响，干旱胁迫下番茄CA活性变化对植株光合作用及水分利用的影响研究[18]表明番茄叶水势和光合速率与CA表达活性之间存在一定的变化趋势相似性；CA可看作植物适应干旱胁迫[18-20]、盐胁迫[21]、低温胁迫[22]等胁迫条件的光合碳代谢调节酶,在保持光合碳代谢稳定方面具有重要功能。综上所述，CA在植物生物岩溶和逆境适应性方面皆具有重要的作用，生物岩溶和逆境适应性是岩溶地区植被恢复及石漠化治理研究的核心内容，所以可将CA研究作为一个重要的切入点，开展云南岩溶生境条件下植被CA活性及其生物岩溶作用机制的相关研究，为云南岩溶地区植被恢复及石漠化治理提供了一种新的理论视角，是解决云南岩溶地区生态系统恢复与重建的重要途径。

目前，以云南岩溶生境的云南松林为研究对象，对云南松CA在岩溶生境中的稳定性和云南松CA活性及其与林内土壤中CA活性的相关性做了一些基础性的前期研究工作[13-14]。但是，关于岩溶环境因子对云南松CA活性的影响、岩溶生境下云南松CA活性的变化规律以及与CA活性密切相关的云南松生长指标研究却缺乏，不仅制约人们对云南松岩溶环境适应性及其生物岩溶作用机制的理解，而且不利于云南松天然林可持续发展、石漠化生态恢复等实践活动。本文以置床第31天的云南松幼苗为试验材料，通过PEG渗透处理模拟干旱胁迫的方式，研究干旱胁迫(主要岩溶环境因子之一)对云南松幼苗生物量和CA活性的影响，探讨云南松幼苗生物量及CA活性随主要岩溶环境因子的变化规律，以CA为切入点，分析云南松幼苗的岩溶生境适应性和其生物岩溶作用机制。为现有云南松天然林的可持续发展和云南松人工林的定向培育提供理论依据和技术支撑，同时丰富我国岩溶生态系统良性生态恢复的机理研究。

1 材料与方法

1.1 材料

以云南松幼苗为试验材料，云南松种子来自于楚雄双柏。

1.2 方法

1.2.1 幼苗模拟干旱胁迫(渗透胁迫)处理 将云南松种子置于底部垫有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿中放置100粒种子，每天开盖通气，定期对每个培养皿补充等量的水分，置床第21天发芽结束；置床第24天，采用两因素四水平的正交试验设计(表1、表2)，利用PEG6000模拟干旱胁迫对幼苗进行干旱处理，每个处理组合4个培养皿，设置64个培养皿；置床第31天，对所有处理统一取样，测定幼苗的生物量和碳酸酐酶活性。

1.2.2 试验材料取样方法 幼苗生物量测定的取样方法，每个处理组合随机取60株生长正常，没有霉坏的云南松幼苗，将整株幼苗按根、茎、叶分开成3个部分，20株为1个重复，设3个重复，备用。碳酸酐酶活性测定取样方法，每个处理组合随机取4 g生长正常，没有霉坏的云南松幼苗，设3个重复，备用。

1.2.3 碳酸酐酶提取 每个处理3个重复，每个处理取新鲜的云南松幼苗4 g，放入预冷的研钵中，加入液氮，再加入3 mL的巴比妥提取缓冲溶液(10 mmol/L，含巯基乙醇50 mmol/L，pH=8.3)进行研磨，将研磨液倒入2 mL的离心管中，置于冰浴中20 min后，在4℃条件下用13 000 r/min离心5 min，取上清液装在2 mL的离心管里冷藏备用[13-14]。

表1 试验的因素水平

表2 模拟干旱胁迫(渗透胁迫)处理强度和处理时间的L16(45)正交试验设计

1.2.4 碳酸酐酶活性测定 云南松幼苗碳酸酐酶活性的测定采用pH计法[13-14]。保持反应系统在0～2℃，取待测粗提液1 mL，加入到含15 mL的巴比妥缓冲液(20 mmol/L，pH8.3)的反应容器中，然后迅速加入10 mL预冷的(0～2℃)饱和CO2蒸馏水，用pH电极监测反应体系pH值的变化，记下pH下降1个单位(8.2～7.2)所需时间，记为te，同时记录同一样品在酶失活条件下pH下降1个单位所需的时间，记为t0，酶的活性用WA-unit表示[13-14]。WA=(te/t0-1)。酶相对活性：(活性/对照活性)×100%。

1.2.5 数据分析 运用SPSS软件进行方差分析和多重比较(Duncan氏新复极差法)[23-25]。

2 结果与分析

2.1 模拟干旱胁迫(渗透胁迫)对云南松幼苗生物量的影响

2.1.1 模拟干旱胁迫(渗透胁迫)对云南松幼苗生物量鲜重的影响 不同渗透胁迫处理对云南松幼苗根、茎、叶及总生物量鲜重影响的变化趋势基本相同，即随着渗透胁迫程度的加深(模拟干旱处理的PEG6000浓度的增大和处理时间的延长)，生物量鲜重总体上皆呈现下降的趋势(图1)。但处理组合13(30%的PEG6000处理1 d)的茎生物量为3.835 g，高于其他的处理组合(包括对照)，且处理组合13的叶生物量(5.224 g)及总生物量(10.706 g)略低于对照但高于其余的处理组合，而处理组合13的根生物量(1.647 g)则是下降的，说明大强度短时间的渗透胁迫对根生长的影响大于其对茎和叶的影响。随着大强度渗透胁迫时间的延长，抑制效应在器官间表现均衡，且幼苗各器官生物量受到的抑制作用更强。

2.1.2 模拟干旱胁迫(渗透胁迫)对云南松幼苗鲜重生物量分配的影响 在不同渗透胁迫处理情况下，云南松幼苗根、茎、叶不同器官生物量排序皆表现为叶>茎>根；且云南松幼苗的叶生物量所占总生物量的比重在46%～53%，茎生物量所占总生物量的比重在26%～36%，根生物量所占总生物量的比重在15%～23%。由此可知，模拟干旱胁迫条件下，云南松幼苗不同器官生物量的分配中，根、茎、叶的占比排序为叶>茎>根，且该占比排序不会随着渗透胁迫强度的增大和时间的延长出现很大的波动，基本保持一个相对稳定的状态(图2)。在不同渗透胁迫处理中，处理5(10%的PEG6000处理1 d)、6(10%的PEG6000处理3 d)、7(10%的PEG6000处理5 d)、8(10%的PEG6000处理7 d)中根生物量所占总生物量的比例皆基本与对照持平，处理9(20%的PEG6000处理1 d)中根生物量所占总生物量的比例最高，为23.29%，处理10(20%的PEG6000处理3 d)、11(20%的PEG6000处理5 d)、12(20%的PEG6000处理7 d)、13(30%的PEG6000处理1 d)、14(30%的PEG6000处理3 d)、15(30%的PEG6000处理5 d)、16(30%的PEG6000处理7 d)中根生物量所占总生物量的比例皆呈现下降的情况，说明根对渗透胁迫强度的增大和时间的延长更为敏感，在处理9的作用强度和时间条件下，云南松幼苗对根占比的调整更有利于其抗逆能力的提高，更高的胁迫强度和更长的胁迫时间不利于云南松幼苗从生物量分配调整方面增强其抗逆能力。

2.2 模拟干旱胁迫(渗透胁迫)对云南松幼苗碳酸酐酶相对活性的影响

在渗透胁迫下，云南松幼苗碳酸酐酶相对活性随着渗透胁迫强度的增大和时间的延长呈先增强后减弱的趋势(表3)。在不同渗透胁迫处理中，所有的胁迫处理组合作用的云南松幼苗的碳酸酐酶相对活性皆大于对照，且处理11(20%的PEG6000处理5 d)中云南松幼苗碳酸酐酶相对活性最大，为86.5%。为进一步认识渗透胁迫不同处理组合对云南松幼苗碳酸酐酶相对活性影响的差异显著性，对各处理组合间的碳酸酐酶相对活性进行了单因素方差分析(表3)，结果P≈0.000<0.01，表明处理组合间的碳酸酐酶活性存在极显著差异，因此进而对各处理组合间的碳酸酐酶相对活性做多重比较(表3)，结果表明4个对照处理(处理组合1、2、3、4)(记作C组)间碳酸酐酶相对活性不存在显著差异，同时处理组合8、9、10、11、12、13(记作A组)间的碳酸酐酶相对活性不存在显著差异，但A组皆极显著的大于处理组合6和16(记作B组)的碳酸酐酶相对活性，且A组和B组皆极显著的大于C组的碳酸酐酶相对活性，处理组合7、14、15(记作AB组)是A组与B组间的过渡组，处理组合5和2(记作BC组)是B组合C组间的过渡组。在渗透胁迫下，云南松幼苗碳酸酐酶相对活性随着渗透胁迫强度的增大和时间的延长呈现出先逐渐增大(增大效果由差异不显著到差异极显著)到峰值后再逐渐减小(减小效果由差异不显著到差异极显著)的情况，表明模拟干旱胁迫(渗透胁迫)诱导了碳酸酐酶相对活性的增强，有利于提高云南松幼苗的抗逆能力，但其碳酸酐酶相对活性增强幅度受制于模拟干旱胁迫(渗透胁迫)的作用强度和延续时间。

表3 不同处理组合模拟干旱胁迫(渗透胁迫)对云南松幼苗碳酸酐酶相对活性影响的描述统计、方差分析与多重比较

注：P<0.01，**表示差异极显著。表4同。

对影响云南松幼苗碳酸酐酶相对活性的渗透胁迫各处理组合因素的水平间的极差分析和方差分析表明，影响碳酸酐酶相对活性的主次因子的排序是A>B>A×B(RA=16.56%>RB=2.20%>RA×B=1.90%)，因素A(PEG6000的浓度)的水平间对酶活性具有极显著的影响(PA≈0.000<0.01)；因素B(处理天数)的水平间对酶活性没有显著的影响；渗透胁迫处理强度和处理时间的交互作用对酶活性强度没有显著的影响；因素A水平间的多重比较结果，X3(记作A组)极显著地大于X2和X4(记作B组)及X1(记作C组),X2和X4(记作B组)极显著地大于X1(记作C组)(表4)，说明干旱胁迫强度对酶活性有极显著的影响，酶活性随着处理液浓度的升高呈现先升高后下降的情况，X3(20%的PEG6000)所产生的模拟干旱胁迫(渗透胁迫)强度应该是云南松调节碳酸酐酶活性提高抗逆能力的转折点。

表4 模拟干旱胁迫(渗透胁迫)因素水平间碳酸酐酶相对活性的方差分析和极差分析

3 结论与讨论

不同模拟干旱胁迫(渗透胁迫)处理对云南松幼苗根、茎、叶及总生物量鲜重影响的变化趋势基本相同，即随着干旱胁迫程度的加深，生物量鲜重总体上皆呈现下降的趋势，同时大强度短时间的渗透胁迫对根生长的影响大于其对茎和叶的影响，这与渗透胁迫对云南松幼苗不同器官鲜重生物量的分配影响的研究结果一致。在处理9的作用强度和时间条件下，云南松幼苗根的生物量占比最大，有利于增强幼苗对水分、养分的吸收。因此幼苗对根占比的调整更有利于其抗逆能力的提高，更高的胁迫强度和更长的胁迫时间不利于云南松幼苗从生物量分配调整方面增强其抗逆能力。

在模拟干旱胁迫(渗透胁迫)下，云南松幼苗碳酸酐酶活性随着渗透胁迫强度的增大和时间的延长呈先增强后减弱的趋势。在不同渗透胁迫处理中，所有的胁迫处理组合作用的云南松幼苗的碳酸酐酶活性皆大于对照，且处理11中云南松幼苗碳酸酐酶活性最大。结合渗透胁迫对云南松幼苗根生物量占比的调整结果来看，当渗透胁迫程度进一步加大时(由处理9到处理11)，云南松幼苗已无法通过调整生物量的分配策略增强其抗逆能力，但云南松幼苗仍可通过增大碳酸酐酶活性，增强其固碳和光合作用能力，以及通过碳酸酐酶在根际土壤中的积累促进岩溶生境土壤中CO2的释放和富集增强幼苗的光合作用，来增强云南松幼苗对岩溶生境的适应能力和其改良岩溶生境的生物岩溶作用。因此，模拟干旱胁迫诱导了碳酸酐酶活性的增强，有利于提高云南松幼苗的抗逆能力，但其碳酸酐酶活性增强幅度受制于干旱胁迫的作用强度和延续时间。

影响碳酸酐酶活性的主要因子是因素A(PEG6000的浓度)，因素A水平间对酶活性具有极显著的影响；因素B(处理天数)、因素A×B(模拟干旱处理强度和处理时间的交互作用)的水平间对酶活性皆没有显著的影响；模拟干旱胁迫(渗透胁迫)强度对酶活性有极显著的影响，酶活性随着处理液浓度的升高呈先升高后下降的情况，X3(20%的PEG6000)所产生的模拟干旱胁迫(渗透胁迫)强度应该是云南松调节碳酸酐酶活性提高抗逆能力的转折点。

受研究时间和试验材料的限制，本文仅以云南松发芽后的幼苗为研究材料，由于模拟干旱胁迫(渗透胁迫)处理时间整体较短，因此在不同器官生物量分配研究方面有一定的局限性(由于幼苗太小，生物量太少，所以本研究采用了鲜重指标，而没有采用干重指标。)，研究结论只代表了该阶段的不同器官生物量分配策略，后续随着苗木的生长和林木的发育，其不同生长阶段在干旱胁迫中的生物量分配策略还有待进一步的深入研究，才能比较全面地认识云南松的干旱胁迫的生物量分配策略。另外，干旱胁迫虽然是岩溶生境的主要环境因子，但岩溶生境同时还存在土壤浅薄贫瘠(缺磷少氮)的问题，因此后续可开展土壤理化性质对云南松生长和碳酸酐酶活性影响方面的研究，综合分析岩溶生境中云南松的适生策略，为进一步筛选适应不同等级石漠化区域的优良云南松单株、家系或无性系提供理论依据和技术支撑。

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