胰头癌患者肠系膜上动脉影像学边界的病理学分析

鲁 蒙 原春辉 张铃福 彭 颖 陶连元 郭丽梅 修典荣

(北京大学第三医院普通外科，北京 100191)

肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)的边界特征与胰头癌的可切除性及术后生存状况密切相关[1～3]。可切除胰头癌的诊断标准之一即为SMA未受肿瘤侵犯[3]，SMA切缘是胰头癌切除标本中环周切缘的重要组成部分，其阳性与否是评估术后肿瘤复发风险的重要因素[4]。胰头神经丛第Ⅱ部(plexus pancreaticus capitalis Ⅱ，PPC-Ⅱ)分布于SMA右侧与胰腺钩突之间，是胰头癌最常见的胰腺外神经侵犯部位[5,6]，该部位神经侵犯可导致SMA切缘阳性，与术后肿瘤的早期复发有关，具有较差的预后[3,7,8]。

腹部增强CT在胰头癌可切除性及胰腺外神经丛侵犯评估方面具有重要价值[9,10]。对于SMA未受侵犯的“可切除胰头癌”，SMA的边界在腹部增强CT中表现为不同特征。正常情况下，SMA周围为清晰的脂肪密度影，提示无神经侵犯。SMA周围脂肪密度影消失、被毛糙软组织影替代被认为是胰头神经丛侵犯的重要特征[11，12]。我科2016年以来常规收集胰头癌患者的PPC-Ⅱ组织并在病理科行HE染色，分析该部位神经丛病变情况。与文献报道不同，腹部增强CT中表现为毛糙SMA边界的胰头癌患者，病理结果提示PPC-Ⅱ神经侵犯发生率较低。Zhang等[13]研究认为胰头癌内存在副交感神经增生现象，与肿瘤的出芽和预后有关。本研究对PPC-Ⅱ行免疫组化染色分析，旨在探究SMA的影像学边界特征与PPC-Ⅱ中副交感神经增生之间的关系。

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1～12月22例胰头癌由我科同一手术医师组施行开腹根治性胰十二指肠切除术作为研究对象。男10例，女12例。年龄45～81岁，(65±9)岁。术前CA19-9 0.6～5201.0 U/ml，中位数167.7 U/ml(我院正常值0～39 U/ml)。3例术中探查静脉受侵，行肠系膜上静脉或门静脉切除重建术。术后电话、门诊随访，随访截止2017年6月，随访时间1～18个月，中位随访时间10个月。所有患者的死亡均与肿瘤复发有关。

病例选择标准：①术后病理证实为胰腺导管腺癌；②行开腹根治性胰十二指肠切除术，切除标本的总体切缘为镜下切缘阴性(R0)或肉眼切缘阴性(R1)；③术前腹部增强CT判断为SMA未受肿瘤侵犯的“可切除胰腺癌”。

病例排除标准：①其他病理类型胰头及周围肿瘤，如壶腹周围癌、胆总管下段癌、胰腺导管内黏液癌、胰腺神经内分泌肿瘤等；②术中冰冻病理证实为肉眼切缘阳性(R2)，行全胰切除术；③术前腹部增强CT判断为SMA受侵犯的“临界可切除胰腺癌”。

1.2 方法

术前均行腹部增强CT检查，采用德国Siemens公司64排螺旋CT仪器，扫描层厚为3 mm。观察腹部增强CT动脉期内SMA自腹主动脉发出后4 cm走行区域内的组织层面，关注每个横断面上SMA周围区域(主要为SMA右侧180°范围内血管与钩突之间)的组织密度差异，并测量5 mm2范围内的平均组织CT值。根据文献[14]报道及临床经验，以-20 Hu为界，将病例分为SMA边界清晰组和SMA边界毛糙组。前者在SMA走行区域内边界清晰，各层面CT值均低于-20 Hu，表现为脂肪密度影(图1A)；后者在SMA走行区域呈现连续、不规则的稍高密度软组织毛糙密度影，软组织CT值大于-20 Hu(图1B)。

胰十二指肠切除术中常规行PPC-Ⅱ清扫(图2A)。术中探查SMA右侧与钩突之间的神经纤维组织，紧贴SMA右侧仔细解剖，以丝线标记SMA根部的神经丛组织，将SMA的前方、右侧和后方完整游离，从而将胰腺钩突部以及PPC-Ⅱ自SMA右侧壁完整锐性分离，达到骨骼化SMA右侧壁的效果(图2B)。将PPC-Ⅱ距钩突边缘约5 mm处平行离断，自SMA根部开始，每隔1 cm切取组织，分别获得距SMA根部1～4 cm处的神经组织。每块神经丛组织块大小约2 mm×2 mm×2 mm，行石蜡包埋制成切片。

对石蜡切片分别进行HE染色、免疫组化染色。免疫组化染色采用抗囊泡乙酰胆碱转运体的兔多克隆抗体(VAChT，1∶100，ab-68984；Abcam，CA，USA)作为第一抗体。将石蜡切片使用二甲苯进行脱蜡及再次水化处理，通过浸润在高压灭菌器内10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复。此后经3%过氧化氢及甲醛处理封闭内源性过氧化物酶活性，使用1%牛血清白蛋白阻止非特异性结合。然后加入VAChT进行孵育，置于4 ℃冰箱内过夜。经磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱后，依次加入生物酰化的第二抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物孵育。在3,3-二氨基联苯胺中浸泡6 min，经10%苏木精复染，脱水后封片。阴性对照以PBS液代替第一抗体(VAChT)。此后切片经病理科医师分析取得染色结果。

1.3 观察指标

主要观察指标包括病理学和早期预后指标。

病理学指标：HE染色常规描述PPC-Ⅱ的主要构成成分、肿瘤神经侵犯情况。免疫组化染色主要分析PPC-Ⅱ中副交感神经增生情况。计数同一病例在距离SMA不同距离的4个标记处PPC-Ⅱ内副交感神经纤维数目，以其总和作为该病例最终的副交感神经纤维数目。同时收集肿瘤主体的病理结果，包括肿瘤大小、淋巴结转移数目、脉管内癌栓、神经侵犯、肿瘤分化程度等。

术后肿瘤分期采用2016年发布的AJCC第8版分期系统[15]。Matsumoto等[16]报道根治性手术后6个月内肿瘤复发的胰腺癌，生存期8～9个月，5年生存率几乎为0，故本研究统计术后6个月内的生存及肿瘤复发情况作为早期死亡及复发指标。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 临床病理学特征

SMA边界清晰组9例，男3例，女6例。年龄(65.7±8.7)岁。SMA右侧区域组织动脉期CT值平均-53.4 Hu(-86.4～-23.9 Hu)。术前CA19-99.7～5201.0 U/ml，中位数153.4 U/ml。无术中联合血管切除重建。低分化腺癌2例，其余7例为高分化和中分化腺癌；R1切除6例，其余3例R0切除；SMA切缘阳性3例；肿瘤内神经侵犯及脉管癌栓分别为8、2例。肿瘤最大径为(3.2±1.2)cm，pT38例，pN14例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为4、5、0例。无早期死亡及复发。

SMA边界毛糙组13例，男7例，女6例。年龄(65.2±10.0)岁。SMA右侧区域组织动脉期CT值平均-11.4 Hu(-15.7～53.0 Hu)。术前CA19-9 0.6～1914.0 U/ml，中位数234.9 U/ml。术中联合血管切除重建3例。低分化腺癌10例，其余3例高分化和中分化腺癌；R1切除8例，其余5例R0切除；SMA切缘阳性3例；肿瘤内神经侵犯及脉管癌栓分别12、4例。肿瘤最大径(3.1±1.4)cm，pT36例，pN16例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为2、6、5例。早期死亡6例，早期复发4例。

2组患者年龄、性别、CA19-9、联合血管切除、肿瘤大小、T分期、N分期、AJCC分期、R1切除、SMA切缘阳性、神经侵犯、脉管癌栓、早期复发等临床病理学特征均无统计学差异(P>0.05)，肿瘤分化程度(P=0.027)、早期死亡(P=0.046)存在显著差异。低分化腺癌和术后早期死亡在SMA边界毛糙患者中比例更高(表1)。

2.2 PPC-Ⅱ病理学分析

PPC-Ⅱ的HE染色结果显示仅1例存在该部位的神经侵犯现象，CT上表现为毛糙的SMA边界,其余患者在HE染色切片中仅发现不同形状特征的神经纤维，并未见神经侵犯。2组患者PPC-Ⅱ神经侵犯上无显著差异性(P=1.000)

100倍光学显微镜下免疫组化染色后的PPC-Ⅱ呈现不同形状及断面的特殊染色的副交感神经纤维，在不同患者中分布密集程度不同(图3)。22例PPC-Ⅱ中副交感神经纤维数目为5～60条，(23.3±14.4)条，其中SMA边界清晰组患者副交感神经纤维数目为(14.8±4.0)条，SMA边界毛糙组患者副交感神经纤维数目为(29.2±16.1)条。不同SMA边界特征之间PPC-Ⅱ中副交感神经纤维数目存在显著差异(P=0.017)，SMA边界清晰者副交感神经纤维数目显著少于SMA边界毛糙者(表1)。

3 讨论

胰头癌是恶性程度极高的消化道肿瘤，以切除率低、术后复发死亡率高为主要特征，预后极差。部分胰头癌患者行根治性胰十二指肠切除术后仍旧出现早期复发或死亡，表明胰头癌的生物学行为存在多样性。目前，胰头癌的恶性程度可通过切除标本的病理学检查进行判断，根据肿瘤侵犯范围、肿瘤大小、淋巴结和脏器转移情况等进行肿瘤分期。神经侵犯是判断胰头癌预后的重要指标。PPC-Ⅱ自SMA右侧神经节发出，神经纤维向胰腺钩突侧走行，主要分布在SMA自腹腔干根部发出后3～4 cm范围内的右侧区域，是胰头癌最常见的胰腺外神经侵犯部位，也是胰腺癌术后复发及死亡的重要原因[17]。在腹部增强CT中，SMA右侧正常的脂肪密度影消失、被软组织密度影替代被认为是该部位神经丛存在肿瘤侵犯的影像学特征[11，12，18]，可通过术前腹部增强CT检查中SMA周围边界特征来判断是否存在胰腺外神经侵犯，从而预测胰头癌的生物学行为。但本组单独送检的PPC-Ⅱ组织术后病理分析表明毛糙的SMA边界与PPC-Ⅱ神经侵犯并非完全对应，与文献[11，12]报道矛盾，提示在术前腹部增强CT中，毛糙的SMA边界可能预示PPC-Ⅱ的其他病理学变化。

图1 SMA边界的CT影像学特征 A. 病例1，胰头癌，男，56岁。腹部增强CT动脉期显示胰头部肿瘤(虚线框内)位于钩突，SMA(短箭头)周围为清晰的脂肪密度影(长箭头)；B. 病例2，胰头癌，女，63岁。腹部增强CT动脉期显示胰头部肿瘤(虚线框内)位于钩突，SMA(短箭头)右侧可见区别于脂肪密度的毛糙状组织阴影(长箭头) 图2 PPC-Ⅱ神经取材示意图 A.胰腺钩突移除后，血管拉钩将SMV拉至左侧，显露出SMA右侧壁,将PPC-Ⅱ组织自SMA右侧壁锐性剥离；B．SMA右侧壁骨骼化后手术创面(SMA：肠系膜上动脉；SMV：肠系膜上静脉；IVC：下腔静脉；黑色箭头：胰腺断面) 图3 副交感神经纤维经免疫组化染色后呈黄色深染结构 A.病例1低倍镜视野(×10)可见副交感神经聚集区域少;B.A中方框内区域在高倍镜视野(×100)下可见副交感神经纤维分布稀疏(箭头)，神经周围可见空泡状脂肪结构。C.病例2低倍镜视野(×10)可见副交感神经聚集区域多;D.C中方框内区域在高倍镜视野(×100)下可见副交感神经纤维分布密集，呈不同形态及断面

组别年龄(岁)性别男女CA19-9(U/ml)*联合血管切除神经侵犯脉管内癌栓SMA边界清晰组(n=9)65.7±8.736153.4(9.7～5201.0)082SMA边界毛糙组(n=13)65.2±10.076234.9(0.6～1914.0)3124t(χ2,Z)值t=0.021Z=-0.334P值0.9050.415**0.7440.240**1.000**1.000**组别PPC-Ⅱ肿瘤侵犯(例)PPC-Ⅱ副交感神经纤维(条)肿瘤最大径(cm)pT3pN1SMA边界清晰组(n=9)014.8±4.03.2±1.284SMA边界毛糙组(n=13)129.2±16.13.1±1.466t(χ2,Z)值t=-2.610t=0.174P值1.000**0.0170.8630.074**1.000**组别AJCC分期(例)123低分化腺癌(例)总体切缘阳性(例)SMA切缘阳性(例)早期死亡(例)早期复发(例)SMA边界清晰组(n=9)45026300SMA边界毛糙组(n=13)265108364t(χ2,Z)值χ2=5.202P值0.0740.027**1.000**0.655**0.046**0.115**

*数据偏态分布，用中位数(最大值～最小值)表示

**Fisher精确检验

副交感神经增生是胰头癌肿瘤微环境内的一种形态学现象，表现为副交感神经纤维在肿瘤基质内的分布，可发生在肿瘤内、胰腺内或胰腺外等。胰头癌存在不同程度的副交感神经增生现象，可能诱导肿瘤出芽，继而导致肿瘤的复发、播散行为[13]。在SMA切缘部位的神经丛亦容易发生肿瘤出芽，导致远处转移[19]。因此，副交感神经增生可能与胰头癌的肿瘤出芽现象有关，易引发胰头癌的复发、播散、远处转移等，是潜在反映胰头癌生物学行为的指标。故本研究对位于SMA切缘部位的PPC-Ⅱ进行副交感神经的免疫组化染色，探究该部位神经丛是否存在副交感神经增生现象。病理分析结果表明，所有患者的PPC-Ⅱ标本中均存在不同程度的副交感神经增生，SMA边界清晰患者PPC-Ⅱ中副交感神经纤维数目为(14.8±4.0)条，显著少于SMA边界毛糙患者(29.2±16.1)条，不同SMA边界特征PPC-Ⅱ中副交感神经增生程度具有明显差异性(P=0.017)，提示副交感神经增生活跃是腹部增强CT中SMA边界毛糙的可能原因。

自主神经系统(交感神经、副交感神经)在胰腺癌中的作用已有相关研究阐述。神经增生不仅指神经纤维在胰腺外的分布生长[13]，也反映肿瘤细胞与神经纤维之间的相互促进作用。肿瘤处于新生长的自主神经纤维网络中，可引起神经病变或“神经重塑”，其病变类型多样，包括神经增生、神经增殖、神经炎症及常见的神经侵犯等[20～22]。本研究中SMA边界毛糙者PPC-Ⅱ发生神经侵犯的概率较低(7.7%，1/13)，但存在较活跃的副交感神经增生现象，副交感神经纤维数目显著高于SMA边界清晰者，表明神经增生与神经侵犯可能均为胰腺癌神经病变的类型，在不同患者中存在不同的表达方式。另外，神经纤维的生长同样可以调节肿瘤的生长出芽，在肿瘤由局部到远处转移的过程中发挥重要作用，与肿瘤复发转移密切关联。SMA边界毛糙组术后早期病死率(46.2%，6/13)明显高于SMA边界清晰组(0%，0/9)(P=0.046)。2组肿瘤分化程度也存在明显差异(P=0.027)，低分化腺癌在SMA边界毛糙者中的比例更高,提示毛糙的SMA边界可能预示更差的预后和更高的肿瘤恶性程度。

PPC-Ⅱ的病理研究有助于发现胰头癌早期复发转移的机制，了解神经病变在调控肿瘤出芽、播散中的作用。同时，研究SMA在术前影像学中的边界特征与PPC-Ⅱ病理结果的关系，有助于术前对胰头癌患者进行预后分层，对患者进行更好的治疗决策。对于SMA边界毛糙的患者，根治性手术可能不会给患者预后带来收益，术前新辅助治疗或其他治疗方案是潜在的治疗方案，但需要进一步研究[8,23]。

本研究存在一些不足。首先，样本数较少，无法进行多因素分析，故无法判断SMA边界特征与各临床病理学特征有无相关性，预后分析也存在一定限制，需要进一步扩大样本数目行免疫组化染色。其次，在PPC-Ⅱ的免疫组化染色分析中，缺乏正常人对照结果，无法对比SMA边界清晰组与正常人是否存在副交感神经增生程度的差别。后期可通过尸体解剖研究获得相关证据。同时，副交感神经纤维粗细、神经纤维周围淋巴细胞增生、交感神经增生等其他病理特征仍需要进一步染色分析。

总之，术前腹部增强CT中SMA边界毛糙现象不限于胰头神经丛的肿瘤侵犯，还预示其他类型神经病变，例如活跃的副交感神经增生等，这些特征均与较差的预后有潜在的关联。进一步对PPC-Ⅱ进行多种免疫组化染色分析、扩大样本量，探究其他可能的神经病变与肿瘤进展的关系，对明确胰头癌肿瘤复发转移机制，探索新的治疗方案都有重大的意义。

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