鹿角形肾结石尿路感染患者肾内Osteopontin的表达意义

杨 立，杨银桂，肖玉坤，李正金，李照坤

（大理大学临床医学院，云南大理 671000）

鹿角形肾结石定义为结石位于肾盂且分支进入肾盏〔1〕，此类鹿角形肾结石常较为复杂并伴有尿路感染、且有难以取净和术后易复发的特点。大理地区为鹿角形肾结石高发地区，探讨鹿角形肾结石伴有尿路感染的发病因素和机制对于这类复杂性肾结石的预防和治疗具有积极意义。

1 资料与方法

1.1 纳入病例纳入2015年3月至2017年2月在大理大学第一附属医院泌尿外科诊断为鹿角形肾结石伴有尿路感染病例30例（1组）和单纯鹿角形上尿路结石表征不伴有尿路感染病例30例（2组）患者。关于尿路感染患者纳入标准：①尿路中段尿培养结果阳性；②尿常规中检测白细胞（++）以上；③尿常规中亚硝酸盐（+）以上，需同时满足上述3个条件中的2个；非尿路感染性患者组需上述3个检测指标条件均不满足后纳入研究组。1组患者年龄25～60岁，平均（38.16±15.94）岁，其中男性患者17人，女性患者13人，行肾脏、输尿管、膀胱平片和静脉泌尿系统成像（KUB+IVU）检查中所测量结石直径平均约（2.95±0.34）cm；2组患者年龄23～65岁，平均（38.20±14.06）岁，其中男性患者14人，女性患者16人，行KUB+IVU检查中所测量结石直径平均约（2.02±0.18）cm。两组患者均无伴随肿瘤性疾病。两组患者一般资料比较，行配对t检验提示两组患者年龄差异无统计学意义（P=1.94＞0.05），结石直径差异无统计学意义（P=0.47＞0.05）。所有患者均通过术前评估存在手术指征，充分术前准备后行经皮肾镜碎石术。术后3 d内上述所有患者再次检测尿常规和送中段尿培养。

1.2 标本采集行B超引导下经皮肾镜碎石并清石后，在确保患者生命体征平稳和肾镜视野清楚的情况下，观察各组病例中肾结石或肾结石分支所在肾盂、肾盏粘膜区域及非结石所分布的集合系统黏膜区域的大体病理变化、肾乳头及周围组织情况。1组病例中可于内镜下观察，如有病理改变区域（尤其是结石分支所在区域黏膜异常改变），用5F活检钳行选择性取材，分别夹取活组织送检（定义为1组a区）；于结石分支未分布的集合系统黏膜区域同法夹取活组织送检（定义为1组b区）。2组病例中于结石所停留肾盂、肾盏和输尿管上段周围黏膜中取材，同法夹取活组织送检（定义为2组a区）；于肾内结石未分布的集合系统黏膜区域同法夹取活组织送检（定义为2组b区）。

仔细检查所有活检部位有明显活动出血者用钬激光或等离子电极电凝止血，检查无出血后常规留置肾造瘘管，术后肾造瘘管夹管4 h，开放肾造瘘管后密切观察尿色情况。

1.3 组织病理观察及OPN检测各组各区活检组织用中性甲醛固定后，石蜡包埋切片后等分2份；其中1∕2作HE染色后观察局部组织病理，另1∕2标本行OPN免疫组化检测（用免疫组化SABC法进行，严格按照试剂盒说明操作，OPN生产厂家：南京森贝伽生物科技有限公司；试剂盒编号：SBJ-H0080）。由两名病理科医生行双盲法阅片，首先低倍镜（×40）下观察全片Osteopontin表达情况，然后高倍视野（×400）下进行观察。采用双评分半定量法进行评分（即根据染色强度和阳性细胞所占比例进行判定）：不着色，0分；黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。阳性细胞所占视野细胞比例的评定标准：阳性细胞率≤10%，0分；10%～25%，1分；25%～50%，2分；＞50%，3分。2项评分相加：0～1分为阴性（-）；≥2分为阳性（+）。

1.4 统计学处理比较各组各区中OPN表达结果，采用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间率的比较用χ2检验，检验水准α=0.05，以P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾局部病理特征1组部分患者（约23∕30=76.7%）行经皮肾镜碎石手术过程中可在内镜下观察到结石所在肾盏局部的大体病理特征，如钙盐沉积、结晶颗粒黏附或“菌斑”残留等。2组患者病例在手术中观察到少部分（4∕30=13.3%）有上述大体病理特征改变。见图1。

其中在1组患者病例中，中段尿培养阳性和鹿角形肾结石所在区域“病理征阳性”有20例患者，2例患者中段尿培养阳性而鹿角形肾结石所在区域病理征阴性，3例患者鹿角形肾结石所在区域病理征阳性而中段尿培养阴性，5例患者上述两者结果均为阴性。用χ2检验相关性分析将上述数据进行分析，在鹿角形肾结石的病例中，中段尿培养与结石所在集合系统黏膜“病理征”存在相关，中段尿培养阳性几率增加，其结石所在集合系统黏膜“病理征”阳性率较大（χ2=9.043，P=0.003），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 钙盐沉积及菌斑残留

2.2 标本HE染色观察1组病例中部分标本的HE染色可见钙盐结晶分布，但2组病例中则较少观察到钙盐结晶分布。两组标本组织视野中钙盐结晶阳性出现率分别为1a区76.70%（23∕30），1b区 13.30%（4∕30），2a区 6.7%（2∕30），2b区 0.0%（0∕30）。钙盐结晶的分布主要与鹿角形肾结石组及所在局部区域相关。

2.3 标本中OPN的表达1组a区，2组a区中所取标本活检行OPN检测分别可见有22例（22∕30）和2（2∕30）呈阳性表达。各组OPN表达情况比较见表1，图2。

图2OPN表达

上述数据表明1组鹿角形肾结石伴有尿路感染的病例中结石所在区域肾盏黏膜的OPN呈现高表达，即使结石未分布伸入的肾盏仍有一定程度表达。而2组病例中不管是结石所在区域及非结石分布区域的集合系统黏膜中都较少有OPN表达。

表1 各组各区中OPN阳性表达情况比较

3 讨论

经典的肾钙斑理论是尿石症发病机制中最重要的假说。学者Randall首先描述了肾乳头表面潜在的肾钙斑，这种斑块位于肾乳头上皮下的内髓间质，并据此提出了结石附着于肾钙斑生长的假说，而附着于肾钙斑生长的结石外表部分凹陷呈脐形且成分为羟磷灰石。根据Evan等学者对8类病因的结石患者的研究结果，结石的初始生长位置分为两类，一类是肾钙斑，另一类是位于Bellini集合管内的钙盐沉积（肾钙栓，Randallplug）〔2〕。不论是肾钙斑还是Randallplug，其都作为结晶物质形成的初始部位，在各种大分子或蛋白调控下进一步促进结石生成并在感染因素诱导下加速这一过程〔3〕。

鹿角形肾结石通常含有磷酸胺镁和碳酸钙∕磷灰石成分，而磷酸铵镁结石类型主要由尿路中能产生脲酶的细菌所致，属于感染性结石的范畴〔4〕。感染是导致鸟粪样鹿角形肾结石（磷酸胺镁为主）形成的重要因素，这个观点和认识早已成定论且为学界公认。而最近研究表明实际上细菌在草酸钙和磷酸钙等为主要成分的结石形成过程中作用更为突出，其可促进蛋白合成进而形成结石基质〔5〕。因此不论鹿角形肾结石的成分如何，感染在促进结石生成过程中都至关重要。在临床中，这类患者的尿常规和尿培养结果常提示有感染存在。本组鹿角形肾结石患者于内镜条件下观察，可在结石局部生成的部位看到有“菌斑”形成，这种“菌斑”类似口腔牙或黏膜表面附着的“细菌集落”病变，其是指基质包裹的互相粘附、或粘附于表面的软而未矿化的细菌性群体，是一种细菌性生物膜。而这些牙菌斑可能导致形成牙结石或结垢〔6〕。而本组病例观察结果亦提示“菌斑”征出现区域主要与鹿角形结石分布有关。

Osteopontin（OPN）是一种非胶原性骨基质的机体反应蛋白，广泛分布于机体的多种组织和细胞中，其可在肾小管的上皮细胞表达且易受机体的水合状态影响〔7〕。作为一种多功能介导因子，其常常在应激反应途径中出现，在感染环境中其表达水平显著增加〔8〕。其可能通过诱导产生和释放可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（soluble urokinase-type plasminogen activator receptor，suPAR）来反馈作用于机体〔9〕，而suPAR与肾脏慢性疾病及损伤有关〔10〕。近年来的研究表明，肾小管上皮细胞氧化损伤在诱导和调控结石形成过程中起到重要作用〔11〕。肾小管上皮细胞的损伤，导致合成并分泌某些基质蛋白，或通过分泌特异的炎性因子促使局部结晶物质较易附着，这些特殊蛋白成分中以OPN较为显著。而国内学者研究发现OPN可使巨噬细胞将结石晶体转运至髓袢基底膜处，从而成为Randall斑的起源〔12〕。

本组标本检测结果显示，在鹿角形肾结石伴有尿路感染病例中骨桥蛋白呈显著表达，且高于单纯鹿角形肾结石组，且这种显著表达与“菌斑”分布存在有关联。在我们临床随访中，尿培养出大肠埃希菌阳性患者多为复发性鹿角形结石。国外研究显示大肠埃希菌所致泌尿系感染可诱导肾小管上皮粘膜损伤，导致骨桥蛋白高表达后促使结晶成核、滞留较易，最终使结石生成〔13〕。结合我们的观察结果，推测作为介导肾小管上皮损伤的蛋白分子OPN较易导致感染性鹿角形结石的形成，且这类结石往往容易在干预后复发。分析原因可能为肾小管上皮黏膜损伤在初次干预或外科术后存在，其术后泌尿系感染几率增加情况下致OPN的高表达，从而加速了结石形成致复发这一过程，但具体机制仍需进一步探讨。在本组鹿角形肾结石伴有尿路感染病例中检测出的菌群依次为大肠埃希菌和奇异变形杆菌，而近来研究表明OPN可通过免疫调节机制导致机体局部炎症状态细菌菌群的紊乱〔14〕。因此对于鹿角形肾结石患者伴随明显局部感染和肾小管上皮黏膜损伤，在上述条件下OPN的调节效应在某种程度上是加速的，这或许为临床上部分复杂鹿角形肾结石患者术后较快复发提供治疗和预防复发的干预思路。

［参考文献］

〔1〕那彦群，叶章群，孙颖，等.中国泌尿外科疾病诊断治疗指南（2004版）〔M〕.北京：人民卫生出版社，2014：166.

〔2〕MANDEVILLE J A，LINGEMAN J E.Umlithiasis：basic science and clinical pratice〔M〕∕∕Talati J J，Tiselius H G，Albala D M，et al.Current understanding of the Role of Randall’s plaque.Berlin：Springer，2012：209-218．

〔3〕BAGGA H S，CHI T，MILLER J，et al.New insights into the pathogenesis of renal calculi〔J〕.Urol Clin North Am，2013，40（1）：11-12.

〔4〕BAZIN D，ANDRE G，WEIL R，et al.Absence of bacterial imprints on struvite-containing kidney stones：a structural investigation at the mesoscopic and atomic scale〔J〕.Urolo⁃gy，2012，79（4）：786-790.

〔5〕SCHWADERER A L，WOLFE A J.The association between bacteria and urinary stones〔J〕.Ann Transl Med，2017，5（2）：32.

〔6〕胡丹阳，张锦龙，崔伟，等.牙菌斑生物膜概述〔J〕.临床军医杂志，2016，44（7）：767-770.

〔7〕LEE S Y，LEE S J，PIAO H L，et al.Hydration status affects osteopontin expression in the rat kidney〔J〕.J Vet Sci，2016，17（3）：269-277.

〔8〕 FORTIS S，KHADAROO R G，HAITSMA J J，et al.Osteo⁃pontin is associated with inflammation and mortality in a mouse model of polymicrobial sepsis〔J〕.Acta Anaesthesiol Scand，2015，59（2）：170-175.

〔9〕VASCHETTO R，NAVALESI P，CLEMENTE N，et al.Os⁃teopontin induces soluble urokinase-type plasminogen acti⁃vator receptor production and release〔J〕.Minerva Anestesi⁃ol，2015，81（2）：157-165.

〔10〕ZEIER M，REISER J.suPAR and chronic kidney diseasea podocyte story〔J〕.Pflugers Arch，2017，469（7-8）：1017-1020.

〔11〕JOSHI S，PECK A B，KHAN S R.nadph oxidase a8 athera⁃peutic target for oxalate induced injury in kidneys〔J〕.Ox⁃id Med Cell Longer，2013，2013：462361．

〔12〕关晓峰，邓耀良，黎承扬，等.巨噬细胞在高草酸尿症大鼠肾内结石晶体形成过程中的作用〔J〕.中华泌尿外科杂志，2010，31（2）：88-91.

〔13〕DJOJODIMEDJO T，SOEBADI D M，SOETJIPTO.Esche⁃richia coli infection induces mucosal damage and expres⁃sion of proteins promoting urinary stone formation〔J〕.Uro⁃lithiasis，2013，41（4）：295-301.

〔14〕ITO K，NAKAJIMA A，FUKUSHIMA Y，et al.The poten⁃tial role of Osteopontin in the maintenance of commensal bacteria homeostasis in the intestine〔J〕.PLoS One，2017，12（3）：e0173629.