大红袍β-羟高铁血红素形成抑制活性研究

陈 浩，刘晓薇 ，沈 怡，崔淑君，肖朝江，姜 北 *

（1.大理大学药物研究所，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

疟疾（Malaria）是当今社会中对人体健康危害最为严重的主要寄生虫病之一。根据世界卫生组织相关的报道，全球每年患病的人数高达1.49～3.03亿，其中死亡人数近百万。2015年全球95个疟疾传播的国家和地区共有2.14亿临床病例，其中88%的疟疾病例和90%的死亡病例发生于非洲地区，少数发生于东南亚地区〔1〕。疟原虫作为疟疾的病原体，目前已知有200余种，寄生于人体内的共有5种，即间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（P.malariae）、恶性疟原虫（P.falciparum）、卵形疟原虫（P.ovale）、诺氏疟原虫（P.knowlesi），分别引起间日疟、三日疟、恶性疟、卵形疟和诺氏疟。在我国主要以间日疟原虫和恶性疟原虫为主〔2〕。但随着近几年我国前往非洲务工人员的增加，其余3种感染病例也在逐年上升〔3〕。与此同时，由于抗疟药的不断使用，疟原虫已对其产生了抗药性，甚至出现了多重耐药性〔4-5〕。因此，研发新一代的抗疟药物刻不容缓。云南植物资源丰富，利用该地区植物资源多样性进行新型抗疟先导成分研究具有极大的可行性。为此本课题组前期采用β-羟高铁血红素形成抑制实验〔6-9〕，对采自云南西部地区64种植物的128个供试样品进行了抗疟活性筛选，结果发现大红袍粗提物具有较好的β-羟高铁血红素形成抑制活性。大红袍系豆科（Leguminosae）杭子梢属（Campy⁃lotropis）植物毛杭子梢［Campylotropis hirtellae（Franch.）Schindl.］的干燥根，主要分布于我国四川、贵州、西藏、云南等地〔10〕，具有止痛活血、调经、收敛的功效〔11〕。为追踪其抗疟活性成分，本实验采用柱色谱和波谱学技术对活性部位进行成分分离和结构鉴定，结果从活性较好的乙酸乙酯部位分离鉴定了3个主要成分，分别是儿茶素（1）、胡萝卜苷（2）、大豆脑苷I（3）。见图1。

图1 化合物1～3的结构

1 材料与仪器

1.1 实验材料本实验所用大红袍（Radix Campy⁃lotropidis Hirtellae）植物样品于2016年7月采自云南省大理市洱源县炼铁乡，经大理大学药学与化学学院生药学教研室张德全博士鉴定，植物标本现保存于大理大学药物研究所姜北教授课题组，标本编号为20160710-3b。

1.2 仪器与试剂BioTek Synergy HT多功能酶标仪（BioTek Instruments Inc.）；RE-5205旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Bruker Avance III-400核磁共振波谱仪（TMS为内标）；CoolSafe 95-15冷冻干燥机（丹麦LaboGene公司）；MCO-18AIC CO2培养箱（日本三洋公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）、氯喹二磷酸盐、氯高铁血红素（美国Sigma公司）；乙酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；冰醋酸、吡啶（上海申博化工有限公司）；氢氧化钠（重庆川东化工集团有限公司）；二甲基亚砜（天津化学试剂有限公司）；盐酸（西陇化工股份有限公司），甲醇、丙酮、氯仿等试剂均为工业级有机溶剂均重蒸后使用；其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 提取分离大红袍（24.1 kg）粉碎后以95%乙醇共冷浸提取6次，减压浓缩所得总浸膏用适量水充分混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行分配，即得相应萃取物。其乙酸乙酯萃取物浸膏（470.0 g）用适量粗硅胶（80～100目）混合拌样后经200～300目硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱（1：0至0：1），经TLC检测后合并相同的流分共得19个组分（A～S）。其中，组分O经硅胶柱层析（氯仿-丙酮）得到化合物1（4.30 g）。组分M经大孔树脂（甲醇-水）和Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱色谱得到化合物2（1.02g）和化合物3（1.41g）。2.2 β-羟高铁血红素形成抑制活性测试方法 β-羟高铁血红素形成抑制活性测试方法参照文献〔6-9〕，并将其进行适当改良后按照如下操作进行，即将50 μL不同浓度的供试样品和50 μL氯高铁血红素储备液（1.0 mmol∕L）分别加于96孔板中，平行设置3个复孔；同时设置蒸馏水溶媒对照组和氯喹阳性对照组。然后每孔加入80 μL醋酸盐缓冲液（pH 5.0，4 mol∕L），置于50 ℃培养箱中孵育5 h，取出96孔板，待其恢复至室温后向每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES（pH 7.5，20 mmol∕L）溶液使96孔板中的固体充分混悬，室温放置待未反应的羟高铁血红素溶解完全后；于每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板中，之后向每孔中加入200 μL吡啶-HEPES溶液进行稀释，并将其置于405 nm波长处测定吸收值。由羟高铁血红素标准曲线得出未反应的羟高铁血红素的浓度，计算出供试品对β-羟高铁血红素形成的抑制浓度（以IC50表示）。

3 实验结果

3.1 受试样品的β-羟高铁血红素形成抑制活性测定结果参照“2.2”的实验方法对大红袍粗提物以及其各溶剂相应萃取物进行了β-羟高铁血红素形成抑制活性测定。见表1。从表1中可以看出，大红袍的粗提物及各溶剂相应萃取部位都具有较好的β-羟高铁血红素形成抑制活性，其中活性最佳脂溶性部位为乙酸乙酯部位，IC50值为（232.7±12.4）μg∕mL。因此，该研究利用硅胶和大孔树脂等柱层析技术方法对活性最好的乙酸乙酯部位进行活性追踪。结果从中分离得到3个化合物，其中化合物1具有一定的β-羟高铁血红素形成抑制活性。见表2。

3.2 结构鉴定化合物1：淡黄色粉末。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.83（1H，d，J=1.9Hz，H-2′），6.76（1H，d，J=8.1Hz，H-5′），6.71（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），5.92（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），5.84（1H，d，J=2.3 Hz，H-6），4.55（1H，d，J=7.5 Hz，H-2），3.97（1H，dt，J=7.9，5.4 Hz，H-3），2.84（1H，dd，J=16.1，5.4 Hz，H-4a），2.50（1H，dd，J=16.1，8.2 Hz，H-4b）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：82.9（C-2），68.8（C-3），28.6（C-4），157.8（C-5），96.2（C-6），157.6（C-7），95.4（C-8），156.9（C-9），100.8（C-10），132.2（C-1′），115.2（C-2′），146.3（C-3′），146.2（C-4′），116.0（C-5′），120.0（C-6′）。上述波谱数据与文献〔12〕报道的基本一致，故鉴定化合物1为儿茶素。

表1 大红袍粗提物β-羟高铁血红素形成抑制活性测定结果（±s，n=3）

表1 大红袍粗提物β-羟高铁血红素形成抑制活性测定结果（±s，n=3）

不同浓度（μg∕mL）植物提取物的β-羟高铁血红素形成抑制率∕%样品名IC50∕(μg∕mL)氯喹二磷酸盐粗提物石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物萃余水相1 388.9 81.7±3.6 51.6±9.8-8.5±1.3 10.7±3.3 49.1±4.4 84.0±1.2 277.8 82.2±3.1 65.6±2.3 54.4±2.3 57.8±5.1 51.4±0.9 68.0±1.6 55.6 82.4±5.3 8.3±0.3 0.5±3.5 21.8±11.5-4.9±2.8-1.2±2.8 11.1 1.0±3.2 2.5±1.7 0.2±0.4-1.6±3.0-0.5±1.8-1.1±0.5 2.2-1.1±1.5 5.3±3.7-1.8±2.1 1.9±2.4-0.9±6.4 1.3±1.4 36.6±1.8 214.4±8.7 262.0±9.6 232.7±12.4 279.6±3.2 215.2±3.3

表2 大红袍中单体化合物β-羟高铁血红素形成抑制活性测定结果（±s，n=3）

表2 大红袍中单体化合物β-羟高铁血红素形成抑制活性测定结果（±s，n=3）

不同浓度（μg∕mL）化合物的β-羟高铁血红素形成抑制率∕%化合物IC50∕(μg∕mL)1 2 3 277.8 14.2±2.1 0.1±0.1-5.2±1.9 55.6 12.6±1.5 1.5±0.8-8.6±0.3 11.1 4.1±1.5 0.5±1.0-5.5±1.5 2.2 6.8±2.0 0.6±0.9-6.2±1.0 0.4 5.1±1.4 0.6±0.5-2.7±0.5＞277.8无活性无活性

化合物2：白色无定型粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.36（1H，brs，H-6），5.09（1H，d，J=7.7Hz，H-1′），4.60（1H，dd，J=11.8，2.4 Hz，H-6′a），4.45（1H，dd，J=11.8，5.2 Hz，H-6′b），4.35（1H，overlap，H-4′），4.33（1H，overlap，H-5′），4.10（1H，m，H-3），4.02（1H，overlap，H-2′），3.96（1H，overlap，H-3′），0.99（3H，d，J=6.4Hz，Me-21），0.93（3H，s，Me-19），0.92～0.85（12H，overlap，4×Me），0.65（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：37.6（C-1），30.4（C-2），78.8（C-3），39.5（C-4），141.0（C-5），122.1（C-6），32.3（C-7），32.2（C-8），50.5（C-9），37.1（C-10），21.4（C-11），40.1（C-12），42.6（C-13），56.3（C-14），24.7（C-15），28.7（C-16），56.9（C-17），12.1（C-18），19.3（C-19），36.5（C-20），19.2（C-21），34.3（C-22），26.5（C-23），46.1（C-24），29.6（C-25），19.6（C-26），20.1（C-27），23.5（C-28），12.3（C-29），102.7（C-1′），75.5（C-2′），78.7（C-3′），71.8（C-4′），78.2（C-5′），62.9（C-6′）。上述波谱数据与文献〔13〕报道的基本一致，故鉴定化合物2为胡萝卜苷。

化合物3：白色无定型粉末。ESI-MS m/z：712［M–H］–。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.73（1H，dt，J=15.3，6.1 Hz，H-5），5.48（1H，dd，J=15.3，7.4 Hz，H-8），5.37（2H，t，J=4.7，H-4，9），4.26（1H，d，J=7.7Hz，H-1′′），4.14（1H，overlap，H-3），4.12（1H，overlap，H-1a），4.00（1H，overlap，H-2′），3.99（1H，overlap，H-2），3.86（1H，d，J=11.8 Hz，H-6′′a），3.70（1H，dd，J=10.3，3.3 Hz，H-1b），3.66（1H，dd，J=11.8，3.7 Hz，H-6′′b），3.34（1H，s，H-3′′），3.28（1H，overlap，H-4′′），3.27（1H，overlap，H-5′′），3.19（1H，t，J=8.4 Hz，H-2′′），2.19～2.01（6H，overlap，H2-6，7，10），1.70（1H，m，H-3′a），1.55（1H，m，H-3′b），1.44～1.28（38H，overlap，H2-11～17，4′～15′），0.90（6H，t，J=6.6Hz，Me-18，16′）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：70.0（C-1），54.9（C-2），73.0（C-3），130.2（C-4），134.6（C-5），33.9（C-6），28.1（C-7），131.5（C-8），131.6（C-9），28.5（C-10），30.8（C-11），30.7～33.3（C-12～16），24.0（C-17），14.7（C-18），177.5（C-1′），73.2（C-2′），36.1（C-3′），26.5（C-4′），30.7～33.3（C-5′～14′），24.0（C-15′），14.7（C-16′），104.9（C-1′′），75.2（C-2′′），78.1（C-3′′），71.7（C-4′′），78.2（C-5′′），62.8（C-6′′）。上述波谱数据与文献〔14〕报道的基本一致，故鉴定化合物3为大豆脑苷I。

4 讨论

β-羟高铁血红素形成抑制实验作为一种体外抗疟活性间接测定的研究方法，具有操作简单、快捷、样品用量少等高通量筛选实验所具备的特性〔6-9，15-16〕。然而，本实验利用硅胶和大孔树脂等柱层析技术方法对活性部位追踪分离得到的3个主要成分，仅化合物1显示出微弱的活性，分析其原因可能有两个：一方面可能是大红袍的β-羟高铁血红素形成抑制活性源自未分离到的某些微量成分或是源自多成分协同作用的结果；另一方面，也有可能是色素干扰实验所致，由于大红袍提取物、萃取部位具有较深的颜色，其对本研究于405 nm波长处测定吸收值可能产生干扰，造成假阳性结果。因此，该植物的β-羟高铁血红素形成抑制活性成因与物质基础仍有待进一步研究。

［参考文献］

〔1〕WORLD HEALTH ORGANIZATION.World Malaria Report 2015〔R〕.Geneva：WorldHealthOrganization，2015.

〔2〕吴观陵.人体寄生虫学〔M〕.4版.北京：人民卫生出版社，2013：190-191.

〔3〕夏志贵，杨曼尼，张少森，等.2011年全国输入性疟疾病例流行病学分析〔J〕.中华疾病控制杂志，2014，18（3）：226-230.

〔4〕SUEBSAENG L，WERNSDORFER W H，ROONEY W.Sensitivity to quinine and mefloquine of Plasmodium falci⁃parum in Thailand〔J〕.Bull World Health Organ，1986，64（5）：759-765.

〔5〕TER KUILE F O，NOSTEN F，CHONGSOPHAJATSIDDH T，et al.Halofantrine versus mefloquine in treatment of mul⁃tidrug-resistant falciparum malaria〔J〕.Lancet，1993，341（8852）：1044-1049.

〔6〕NCOKAZI K K，EGAN T J.A colorimetric high-throughput B-hematin inhibition screening assay for use in the search for antimalarial compounds〔J〕.Anal Biochem，2005，338（2）：306-319.

〔7〕AGUIAR A C C，SANTOS R D M，FIGUEIREDO F J B，et al.Antimalarial Activity and Mechanisms of Action of Two Novel 4-Aminoquinolines against Chloroquine-Resistant Parasites〔J〕.PLoS ONE，2012，7（5）：e37259.

〔8〕刘子琦，肖朝江，张小东，等.滇西地区10种植物抗疟活性研究〔J〕.大理学院学报，2015，14（4）：1-4.

〔9〕单华，刘子琦，陈颖志，等.24种白族惯用植物β-羟高铁血红素形成抑制活性〔J〕.大理大学学报，2016，1（10）：1-4.

〔10〕中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第41卷〔M〕.北京：科学出版社，1995：95-97.

〔11〕《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编〔M〕.2版.北京：人民卫生出版社，1996：56.

〔12〕BADR J M，SHAALA L A，YOUSSEF D T A.Loranthin：A new polyhydroxylated flavanocoumarin from Plicosepal⁃us acacia with significant free radical scavenging and anti⁃microbial activity〔J〕.Phytochemistry Letters，2013，6（1）：113-117.

〔13〕EL-SHANAWANY M A，SAYED H M，IBRAHIM S R M，et al.Chemical constituents，anti-inflammatory，and anti⁃oxidant activities of Anisotes trisulcus〔J〕.Bulletin of Fac⁃ulty of Pharmacy，Cairo University，2014，52（1）：9-14.

〔14〕KIM S Y，CHOI Y H，HUH H，et al.New antihepatotoxic cerebroside from Lycium chinense fruits〔J〕.J Nat Prod，1997，60（3）：274-276.

〔15〕CHONG C R，SULLIVAN D J J.Inhibition of heme crystal growth by antimalarials and other compounds：implica⁃tions for drug discovery〔J〕.Biochem Pharmacol，2003，66（11）：2201-2212.

〔16〕FITCH C D，CHEVLI R，KANJANANGGULPAN P，et al.Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent〔J〕.Blood，1983，62（6）：1165-1168.