紫地榆中4种单体对3种致龋菌培养液中大分子物质吸光值的影响

2018-04-21李梦琪罗胤珠

大理大学学报 2018年2期

李梦琪，罗胤珠，卢燕，蓝海

（大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

龋病是危害人类口腔健康的一大疾病，是口腔的常见病。在我国人群患龋率为40%，其中儿童高达80%〔1-2〕。它不仅影响美观，还给人们的日常生活造成极大的困扰，WHO将其列为重点防治的非传染性的三大疾病之一。现代研究表明，人类龋病最重要的致病因子主要分为链球菌属（Mutans streptococci）、乳杆菌属（Lactobacillus Beijerinck）和放线菌属（actinomyces）〔3-6〕。现选取链球菌属中的变形链球菌、放线菌属中的黏性放线菌、乳杆菌属中的嗜酸乳杆菌进行实验。

紫地榆（Geranium strictipes）是牦牛儿苗科老鹳草属植物，药用部位为根。前期实验证明，紫地榆的乙酸乙酯、正丁醇等提取部位对致龋菌具有抑制作用〔7-9〕。从紫地榆中分离的物质包括没食子酸、没食子酸甲酯、鞣花酸、儿茶素等12种成分〔10-11〕。现选取含量较高的没食子酸、没食子酸甲酯、鞣花酸、儿茶素4种单体对3种致龋菌变形链球菌、黏性放线菌、嗜酸乳杆菌的培养液中大分子物质吸光值进行测定，为更进一步研究紫地榆对致龋菌的作用提供基础。

1 材料和仪器

1.1 材料供试菌种为变形链球菌（Streptococcus mu⁃tans）ATCC 25175，黏性放线菌（Actinomyces viscosus）ATCC 277044，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）ASI.1854，以上菌株均购于广东省微生物菌种保藏中心。没食子酸、没食子酸甲酯标准品购于山东西亚化学股份有限公司，儿茶素标准品购于上海源叶生物科技有限公司，鞣花酸标准品购于上海麦克林生化科技有限公司，胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（Trypticase-phytone-yeast extractm edium，TPY）固体及液体培养基、MRS固体及液体培养基均购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），TGL-16A高速离心机（常州迈科诺仪器有限公司），超净台（苏州市金净净化设备科技有限公司），2.5 L圆底立式厌氧培养袋（青岛海博生物技术有限公司），紫外分光光度计（北京普析通用仪器公司）。

2 方法

2.1 菌液的制备在37℃、80%N2、20%CO2、厌氧条件下用TPY液体培养基（嗜酸乳杆菌用MRS液体培养基）培养复苏48 h后的菌种培养18 h。通过生化鉴定及涂片检查为纯培养后，分别挑取单个菌落于TPY液体培养基（嗜酸乳杆菌用MRS液体培养基）在相同条件下培养18 h增菌，使用麦氏比浊管调整菌悬液浓度至0.5 McFarland（108CFU∕mL）备用〔12〕。

2.2 紫地榆中4种单体对3种致龋菌培养液中大分子物质吸光值的影响根据没食子酸、没食子酸甲酯、鞣花酸、儿茶素对3种细菌的MIC（最小抑菌浓度）和MBC（最小杀菌浓度）的测定结果，选取MIC值以下的4个浓度梯度配制成TPY液体培养基（嗜酸乳杆菌用MRS液体培养基）。按菌悬液与TPY液体培养基（嗜酸乳杆菌用MRS液体培养基）比例为1：10（v/v）比例接种此菌后，置37 ℃、80%N2，20%CO2、厌氧条件下摇动培养。分别在0、2、4、6、8、10 h时取样液5 mL，3 000 r∕min离心15 min，取上清液备用。用紫外分光光度计在260 nm处测定上清液中DNA、RNA等大分子物质的吸光度。阴性对照组为不含药物的培养基中细菌的吸光度，阳性对照组为含0.05%洗必泰的培养基中的细菌吸光度〔13〕。每组有3个平行管，实验重复3次。

3 结果和分析

本实验测定的是紫地榆中4种单体对3种致龋菌作用后细菌的培养液中大分子物质的外漏量。因为大分子物质如DNA、RNA等在260 nm波长处有较强的吸收，所以用大分子物质在260 nm波长处的吸收值的变化推测细菌细胞膜的完整性。在0～8 h内，没食子酸0.5～2.0 mg∕mL、没食子酸甲酯1～2 mg∕mL、儿茶素0.125～0.500mg∕mL、鞣花酸0.25～0.50 mg∕mL对变形链球菌培养液电导率的作用效果优于阳性药物。见图1。

在0～10h内，没食子酸0.5～2.0mg∕mL、没食子酸甲酯0.125～1.000mg∕mL、儿茶素0.0625～0.2500mg∕mL、鞣花酸0.031 25～0.250 00 mg∕mL对黏性放线菌培养液电导率的作用效果优于阳性药物。见图2。

在0～8 h内，没食子酸0.25～2.00 mg∕mL、没食子酸甲酯0.25～1.00 mg∕mL、儿茶素0.25～1.00 mg∕mL、鞣花酸0.125～0.500 mg∕mL对嗜酸乳杆菌培养液电导率的作用效果优于阳性药物。见图3。

图1 紫地榆中4种单体对变形链球菌培养液中大分子物质吸光值的影响

图2 紫地榆中4种单体对黏性放线菌培养液中大分子物质吸光值的影响

图3 紫地榆中4种单体对嗜酸乳杆菌培养液中大分子物质吸光值的影响

由图1～3可以看出没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素、鞣花酸4种单体对变形链球菌、黏性放线菌、嗜酸乳杆菌培养液中大分子物质的外漏有增强作用。并且随时间和药物浓度的增加，大分子物质的吸光值逐渐增大。由实验可以看出与空白组相比，4种单体可明显增加大分子物质在260 nm的吸光值，表明细菌细胞内DNA、RNA等大分子物质外漏，细菌细胞膜通透性增加，细胞膜的完整性遭到破坏。

4 讨论

本实验对紫地榆中的4种单体对3种致龋菌培养液中大分子物质吸光值进行了研究，结果显示不同浓度的没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素、鞣花酸均能增加变形链球菌、黏性放线菌、嗜酸乳杆菌培养液中大分子物质的吸光值，且随时间和药物浓度的增加而增大。

在0～2 h内吸光值变化较小，主要原因为细菌数量较少，培养液中大分子物质较少。在2～8 h内细菌成对数级增长，此时药物对细菌作用明显，破坏细菌细胞膜的完整性，使细菌内大分子物质外漏，培养液的吸光值增加。8 h以后，细菌生长缓慢，细菌内大分子外漏减少，培养液的吸光值增长变缓。实验中随浓度增加，培养液的吸光值越大，是因为药物浓度越大，对细菌的细胞膜破坏越大，细菌内大分子外漏越多，培养液吸光值越大。与阳性对照组相比，大多数组的效果优于阳性对照组，说明紫地榆中4种单体对3种致龋菌的细胞膜有破坏作用。推测其原因可能是没食子酸等4种单体诱导菌体产生了某些酶，降解了细胞膜，或者是药物与菌体细胞膜结合，破坏了细胞膜的完整性，使细胞内物质外漏。

综上所述，不同浓度的没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素、鞣花酸能增加变形链球菌、黏性放线菌、嗜酸乳杆菌细胞膜的通透性，使细胞膜的完整性遭到破坏。为研究紫地榆在防龋方面的作用提供了理论依据，对龋病的进一步研究和开发新型防龋药物提供帮助。

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