米曲霉双菌株组合制曲对产蛋白酶的影响

李　鹏， 张艳芳，　王选年*

（1.新乡学院 生命科学技术学院，河南 新乡453003；2.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州450000）

米曲霉是食品用蛋白酶主要来源菌株，具有很强的蛋白酶合成能力，其所产蛋白酶能够在较广的pH值范围内保持活力。蛋白酶是酱油酿造最重要的酶，对于酱油产品的品质以及生产成本具有决定性的作用[1]。目前国内传统的酱油酿造采用的是单菌种沪酿3.042，但是其所产酶系过于单一，成品酱油香气及色泽存在不足[2]。制曲是酱油酿造过程中最关键的步骤之一，成曲的优劣不仅对于氨基酸产生率和蛋白质利用率至关重要，而且还能影响到酱油挥发性风味成分的形成[3]。混合菌种制曲能够完善酶系，弥补单菌种制曲酶系不完整、酱醅中酶类比例不协调的缺陷，促进成品酱油品质和出品率[4]。张齐军[5]、程世杰[6]、靳文生[7]等采用米曲霉、黑曲霉等混合制曲完善了酶系、提高了蛋白酶产量，但有报道指出混合菌种制曲中添加黑曲霉不但不能有效改善酱油风味，且对色泽和香气产生副作用[8]。

氨肽酶（aminopeptidase）是自然界中普遍存在的一种重要的蛋白酶类，能够催化肽链氨基末端肽键进行水解。其中有些氨肽酶不仅能够水解多肽，还能水解完整的蛋白酶[9]。由于肽段呈苦味的部分原因是由于肽链N末端的碱性氨基酸的存在，所以氨肽酶具有很强的脱苦能力[10]。米曲霉是氨肽酶重要的来源菌之一，早在20世纪70年代就有日本学者从米曲霉中分离出亮氨酰氨肽酶进行实验研究[11]。唐文竹等通过对一株米曲霉菌株进行发酵条件优化，使其胞外氨肽酶活性较优化前提高了3倍以上[12]。

本研究中参考混合菌种协同作用的制曲方式，以2种米曲霉菌株为出发菌株进行组合制曲，来提高制曲中性蛋白酶和氨肽酶的酶活力，以期对提高酱油发酵蛋白质利用率有所帮助。

1　材料与方法

1.1　菌种

米曲霉 （Aspergillus oryzae） 菌株：CICC2339，CICC2066购于中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2　培养基和菌种培养方式

1.2.1培养基

1）斜面培养基：PDA培养基。

2）制曲培养基：按照麸皮∶豆粕=4∶1的质量比在250 mL的锥形瓶中加入20 g过10目筛的干料，然后加入干料质量分数80%的蒸馏水，混匀，于121℃、0.1 MPa灭菌40 min。

1.2.2菌种培养方式用无菌水洗脱于4℃保存的米曲霉PDA斜面，制备成孢子悬液，采用血球板计数法计算孢子个数，调整孢子悬液浓度为1.28×107个孢子/mL。接种制备好的1 mL孢子悬液于制曲培养基中，混匀后30℃培养。

1.3　实验方法

1.3.1粗酶液的提取方法中性蛋白酶粗酶液：取1 g 于 30 ℃培养后的固体干曲，按照 1∶20（g∶mL）加入0.1 mol/L pH 7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，于40℃水浴中浸提1 h，间歇搅拌，用4层纱布过滤即得粗酶液。

氨肽酶粗酶液：取1 g于30℃培养后的固体干曲，按照 1∶20（g∶mL）加入 0.1 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液，放置4℃过夜，4层纱布过滤得粗酶液。

1.3.2酶活性的测定方法

1）中性蛋白酶测定采用福林-酚法。参考中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法（GB/T23527-2009）。中性蛋白酶的测定pH值为7.2。

酶活定义：1 g干曲在40℃、pH 7.2条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位。

2000年，小布什在美国总统大选期间大骂《纽约时报》记者为“白痴”。他骂道：“真是白痴。”随即，小布什的竞选搭档切尼附和说：“没错，而且是第一！”两人都不知，当时麦克风没关。

计算公式：U=A×K×4/10×n（1）式（1）中，A：平均吸光度值；K：吸光常数；4：反应试剂的总体积；10：反应时间；n：酶液稀释倍数。

2）氨肽酶测定采用亮氨酸对硝基苯胺法。酶活定义：在40℃、pH 7.2的条件下，每分钟水解亮氨酸对硝基苯胺生成1 μg对硝基苯胺（pNA）所需的酶量定义为一个酶活力单位。

酶活力计算公式：U=A×V1×D/（k×t×V2）（2）式（2）中，V1：反应总体积；V2：酶液体积；D：酶液的稀释倍数；k：消光系数；t：恒温反应时间。

1.3.3单菌株制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性检测实验分别取1 mL 1.28×107个孢子/mL的孢子悬液加入制曲培养基中，于30℃培养24 h后检测中性蛋白酶和氨肽酶活性。

1.3.4双菌株组合制曲实验将与单菌株培养时孢子浓度相同的2株米曲霉菌株CICC2339和CICC2066的孢子悬液共1 mL按孢子数比例接种于制曲发酵培养基进行双菌株组合制曲（见表1，孢子液体积比值），每个组合设3个重复，于30℃培养38、42 h和44 h，然后称取1 g干曲进行中性蛋白酶和氨肽酶活性检测。

表1　双菌株组合曲孢子接种体积比例Table 1　Inoculation ratio of two strains-combination koji making

2　结果与讨论

2.1　单菌株制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性检测结果

A（CISS2339）、B（CICC2066）单菌株制曲过程中性蛋白酶活性变化如图1所示，A、B菌株制曲中性蛋白酶活性在42 h分别达到最高的830.8 U/g（干曲）和1 187.7 U/g（干曲）。中性蛋白酶能够水解蛋白质产生肽段，B的中性蛋白酶活力较A菌株低，说明B菌株对蛋白质进行水解产生肽段的能力较弱。

图1　单菌株曲中性蛋白酶活性Fig.1　Neutral protease activity of single strain koji

A、B单菌株制曲过程中氨肽酶活性变化如图2所示，B菌株制曲氨肽酶活性在60 h达到201.4 U/mL，A菌株在42 h达到93.2 U/mL，虽然B菌株氨肽酶活性较高，但氨肽酶产量到达峰值的时间较长，且由于其中性蛋白酶活力较低，不能有效地利用氨肽酶高活性的优势来水解多肽以及提高酱油酿造过程中游离氨基酸的生成率。

图2　单菌株曲氨肽酶活性Fig.2　Aminopeptidase activity of single strain koji

2.2　组合制曲实验结果

按表1所示的比例，将A和B菌株进行组合制曲培养，在38、42 h和44 h检测制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性，检测结果见图3和图4。

图3　组合曲中性蛋白酶活性Fig.3　Neutral protease activity of combination koji

图4　组合曲氨肽酶活性Fig.4　Aminopeptidase activity of combination koji

由图3所示，各编号组合制曲中性蛋白酶活性均在42 h达到最高，A6B4在所有组合中达到最高的1 366.8 U/g（干曲），图4中A6B4在42 h氨肽酶活性达到最高的148.7 U/mL。A6B4在保持中性蛋白酶活性高的基础下具有较高的氨肽酶活性，在酱油酿造过程中提高了对蛋白质的水解能力以及肽段水解产物中游离氨基酸的产量。

2.3　单菌株制曲与组合制曲实验结果的比较

酱油酿造过程中不同蛋白酶扮演着不同的重要角色，所以制曲要综合考虑中性蛋白酶和氨肽酶的活性情况。将制曲时间为42 h的A菌株和B菌株粗酶液按体积比6∶4直接混合后检测中性蛋白酶和氨肽酶活性，检测结果与A6B4进行比较，结果见表2。

表2　单菌株曲与组合曲蛋白酶活性比较Table 2　Comparison of protease activity between single strain koji and combination koji

由表2所示，A6B4制曲42 h其中性蛋白酶和氨肽酶活性均高于A、B单菌株培养和酶液混合，这说明A6B4组合在酱油酿造过程中其制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性具有较大优势。

3　结　语

通过调节制曲培养基接种孢子的体积比，对2株米曲霉菌株A、B进行组合制曲，以中性蛋白酶和氨肽酶活性为指标得到最优组合A6B4。A6B4在pH 7.2、30℃条件下制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性在42 h分别达到最高的1 366.8 U/g（干曲）和148.7 U/mL，且均高于传统酱油酿造米曲霉菌株As.3.042。A6B4既拥有A菌株高中性蛋白酶活性的特点，又具有B菌株高氨肽酶活性的优势，不但在酱油酿造过程中能够更有效地水解蛋白质产生多肽，而且氨肽酶活性的提高有助于水解酱油产物中的肽段产生游离氨基酸，从而达到去除产品苦味，提升风味的目的，这对于酱油品质的改善具有重要意义。

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