血清miR-26a、miR-122、AFP联合检测对肝癌的诊断效能

赵文淘，韩留鑫，夏加伟，余向琼，白彬，沈丽达

(1昆明医科大学第三附属医院，云南省肿瘤医院，云南省癌症中心，昆明650118；2昆明市第三人民医院)

原发性肝癌起病隐匿、恶性程度高、早期诊断困难、预后差[1,2]。甲胎蛋白(AFP)作为一个重要的肝癌诊断标志物在临床上广泛应用，但其敏感度仅为39%～65%、特异度为76%～94%，诊断效率有限[3]。因此寻找高敏感度、高特异度的肝癌诊断标志物是临床亟待解决的难题。微小RNA(miRNAs)是一类长度约22个核苷酸序列的单链非编码小RNA，在肝脏中表达丰富，其通过调控特定的靶基因表达在新陈代谢、发育、凋亡、分化、病毒感染及肿瘤发生等过程中发挥重要作用[4]。miRNAs表达改变可能是肝炎、肝癌发生的关键机制[5,6]。现已经证实，外周血中的miRNAs可作为早期诊断肝癌的标志物[7]。miR-122是含量最丰富的肝脏特异miRNA，占肝脏miRNAs的70%[8]，我们前期研究也发现miR-122可抑制肝癌的侵袭转移[6]。也有研究[9]报道，miR-26a参与了肝癌的发生及发展过程，在肝癌动物模型体内上调miR-26a表达后，癌结节可消退[10]。本研究观察了血清miR-26a、miR-122联合AFP检测在肝癌诊断中的应用价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取昆明医科大学第三附属医院(云南省肿瘤医院)2016年10月～2017年3月收治的新发肝癌患者114例(肝癌组)，其中男100例、女14例；年龄(51.8±11.5)岁；乙型肝炎108例，丙型肝炎4例，无肝炎2例；所有患者均经穿刺活检或术后病理证实为原发性肝细胞癌，并未进行过针对性抗肿瘤治疗。另选新发肝炎患者87例(肝炎组)，其中男61例、女26例；年龄(44.2±12.8)岁；所有患者均临床确诊为乙型肝炎(78例)或丙型肝炎(9例)，且未经抗病毒治疗。随机选取同期来院做健康体检的健康人94例为对照组，其中男44例、女50例；年龄(40.2±10.2)岁；排除肿瘤、传染病等病史。抽取三组外周血，收集血清，置于-80 ℃冰箱备用。

1.2 血清miR-26a、miR-122检测 采用TRIzol试剂和RNA提取试剂盒提取血RNA[11]。用Nanodrop ND-1000检测仪检测RNA浓度。采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA[12]。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，确定基因序列。使用软件Primer premier5.0进行引物设计。以cel-miR-39为内参，上游引物序列为5′-GCGGTCACCGGGTGTAAATC-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-26a逆转录引物序列为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-

CTGGATACGACAGCCT-3′，其qPCR反应时的上游引物为5′-GACTGTTCAAGTAATCCAGGATA-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；miR-122上游引物序列为5′-GACTGTGGAGTGTGACAATGGTG-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。qPCR反应体系20 μL，包括cDNA 1.33 μL、2×Taqman PCR master mixture 10 μL、TaqMan MicroRNA Assay 1 μL、ddH2O 7.67 μL。用ABI7500型实时定量PCR仪进行qPCR反应，反应条件为95 ℃预变性10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，进行40个循环反应。以cel-miR-39作为内参，采用公式[11]计算miRNA相对表达量，ΔCtmiRNA值越低代表miRNA的表达水平越高。

1.3 血清AFP检测 采用电化学发光法检测三组血清AFP。

2 结果

肝癌组、肝炎组、对照组中miR-26a ΔCtmiRNA值分别为20.59±2.54、15.96±3.79、15.29±2.10，miR-122 ΔCtmiRNA值分别为8.35±2.90、11.48±3.06、13.79±2.84，AFP水平分别为(18 207.78±3 701.95)、(12.15±2.79)、(3.51±0.17)ng/mL。肝癌组miR-26a相对表达量低于肝炎组和对照组，AFP水平高于肝炎组和对照组，肝癌组、肝炎组、对照组miR-122相对表达量依次降低(P均<0.05)。

分析miR-26a、miR-122在肝癌诊断中的效能结果显示，miR-26a、miR-122均可作为鉴别肝癌患者和健康人的标志物：miR-26a单项检测AUC为0.738(95%CI为0.631～0.846)，miR-122单项检测的AUC为0.828(95%CI为0.736～0.919)。miR-26a检测诊断临界值为18.26，敏感度和特异度分别为52.1%、94.3%；miR-122检测诊断临界值为10.63，敏感度和特异度分别为79.9%、84.8%。AFP单项检测AUC为0.801(95%CI为0.702～0.900)，敏感度和特异度分别为59.2%、93.7%。miR-26a、miR-122、AFP联合检测AUC为0.926(95%CI为0.871～0.981)，敏感度和特异度分别为86.4%、82.5%。三项指标联合检测对肝癌的诊断效能高于单一指标检测。

分析miR-26a、miR-122在肝癌和肝炎鉴别诊断中的效能结果显示，miR-26a单项检测AUC为0.752(95%CI为0.645～0.860)，miR-122单项检测AUC为0.688(95%CI为0.571～0.806)。miR-26a检测诊断临界值为16.81，敏感度和特异度分别为73.9%、72.4%；miR-122检测诊断临界值为9.01，敏感度和特异度分别为78.2%、59.4%。AFP单项检测AUC为0.701(95%CI为0.587～0.816)，敏感度和特异度分别为58.3%、92.6%。miR-26a、miR-122、AFP联合检测AUC提高到0.865(95%CI为0.781～0.949)，敏感度和特异度分别为76.5%、85.1%。三项指标联合检测对肝癌和肝炎的鉴别诊断效能优于单项指标检测。

3 讨论

肝癌恶性程度高、起病隐匿，早期诊断并手术切除是延长患者生存期的关键，但多数通过影像学检查发现的肝癌已为晚期，失去手术机会。目前除了影像学诊断方法，实验室主要通过检测血清AFP来辅助诊断肝癌，但AFP的诊断效率有限，有近三分之一的早期肝癌被漏诊[13]。因此，急需寻找一种准确、便捷的诊断肝癌的血清学指标。

miRNAs调控着人类基因组中超过60%的基因表达，某个miRNA的表达变化能够影响着数百个靶基因表达，并显著改变了转录组基因的表达谱[14]。包括肿瘤在内的多种疾病的发生可能是miRNAs表达谱改变所导致的。研究表明，肝脏中的miRNAs通过凋亡、坏死等过程或通过外泌体分泌、病毒颗粒分泌等过程，释放入外周血中，并且miRNAs在外周血中的表达相当稳定[15]，可以作为肝癌早期诊断标志物[7]。

miR-26a在肝癌中发挥着抑制肝癌细胞增殖和转移的功能[9]。Zhou等[16]研究显示，miR-26a在肝癌患者外周血中的表达低于健康对照者，外周血中miR-26与其他六个miRNAs(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-27a、miR-801)的组合检测有助于诊断肝癌。Tan等[17]的研究也显示miR-26a在肝癌患者外周血中的表达低于健康对照者，外周血中miR-26a、miR-206、miR-141-3p、miR-433-3p、miR-1228-5p、miR-199a-5p、miR-122-5p、miR-192-5p联合检测也可用于肝癌的诊断。miR-122作为含量最丰富的肝脏特异miRNA，发挥着抑制肝癌细胞增殖和转移的功能[6]。多项研究[12，18～20]结果显示，miR-122在肝癌患者外周血中的表达高于健康对照者，将miR-122与其他miRNAs联合检测可用于肝癌的诊断。

在本研究中，我们检测了三组血清miR-26a、miR-122、AFP，并评价了三项指标检测在肝癌诊断中的应用价值。研究结果显示，肝癌组miR-26a相对表达量低于肝炎组和对照组，AFP水平高于肝炎组和对照组，肝癌组、肝炎组、对照组miR-122相对表达量依次降低。ROC曲线分析结果显示，miR-26a、miR-122、AFP单项检测诊断肝癌的AUC分别为0.738、0.828、0.801，三项指标联合检测的AUC提高到0.926，对肝癌的诊断效能明显提高。同时，我们还评价了miR-26a、miR-122、AFP单项与联合检测在肝癌和肝炎鉴别诊断中的价值，结果显示三项指标同样能将肝癌和肝炎患者进行鉴别，miR-26a、miR-122、AFP单项检测的AUC分别为0.752、0.688、0.701，三项指标联合检测的AUC则提高到0.865。以上研究结果说明，miR-26a、miR-122可以作为肝癌的诊断标志物，并且与AFP单独检测相比，miR-26a、miR-122、AFP联合检测对肝癌的诊断效率明显提高。上述研究结果与既往相关报道一致，且本研究只将两个指标与临床常用的AFP联合检测即达到较高的诊断效能，优化了诊断方法。本研究提供了一种准确、便捷的肝癌血清学诊断方法，但还需大样本的前瞻性研究来进一步验证。

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