含有草苁蓉环烯醚萜苷的大鼠血清对人肝癌细胞增殖、凋亡影响及其机制

郑峰，崔香丹，金雪峰，全吉淑，尹学哲

(1延边大学附属医院，吉林延吉133000；2临沂市人民医院；3延边大学基础医学院)

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。多数肝癌发现时已属于晚期，失去了手术的最佳时机，介入治疗及化疗的不良反应较大，靶向治疗费用较高，患者生活质量改善仍不太理想。大量临床研究表明，中医药治疗肝癌能够减轻临床症状，延长生存期，提高生存质量，并且毒性反应较轻[1，2]。草苁蓉为列当科本草植物，因其具有补肾壮阳、滋补强身及延年益寿的功效，常被用于治疗肾虚阳痿、腰膝冷痛、肠燥便秘等疾病[3]。我们前期实验表明，草苁蓉的主要提取物草苁蓉环烯醚萜苷(IGBR)是草苁蓉有效的药理成分，具有清除自由基、抗脂质过氧化及抗肿瘤的作用[4～6]。草苁蓉环烯醚萜苷是复合物，不是单体成分，经过前期预实验发现单独加药对癌细胞没有杀伤作用。我们查阅相关文献后，发现草苁蓉环烯醚萜苷经过机体复杂代谢，血清中含有抗癌成分马钱子苷等单体，从血清作为培养基具有抗癌作用。为此，本研究观察了含IGBR大鼠血清对人肝癌SMMC-7721细胞形态、增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物及主要实验材料 人肝癌细胞株SMMC-7721购自武汉博士德有限公司，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中培养。Wistar雄性大鼠60只，体质量150～180 g，由延边大学实验动物中心提供。IGBR由延边大学全吉淑教授惠赠。RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国BD公司。Bcl-2、Bax多克隆抗体购自美国CST公司。直径0.22 μm过滤器购自德国默克密理博公司。超速冷冻离心机购自美国Sigma公司。倒置显微镜购自美国Bio Rad公司。分光光度计购自北京拜西欧斯生物技术有限公司。流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 含IGBR大鼠血清(药物血清)的制备 60只Wistar雄性大鼠适应性饲养1周后，随机分为生理盐水组、低剂量IGBR组、中剂量IGBR组、高剂量IGBR组，每组15只。生理盐水组给予生理盐水0.1 mL/100 g灌胃，低、中、高剂量IGBR组分别给予125、250、500 mg/kg的IGBR灌胃，1次/d，连续灌胃1个月后麻醉大鼠并心脏取血。全血静置2 h，经4 ℃、3 000 r/min离心20 min后，抽取上层血清，置于56 ℃恒温水浴箱中水浴30 min用以灭活血清中补体成分，经0.22 μm过滤器除菌，制备成的药物血清分装后保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 SMMC-7721细胞分组及药物血清用法 SMMC-7721细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至细胞贴壁单层覆盖后，用胰酶消化3 min，收集细胞后将细胞密度调整为1×104/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，加入无血清的RPMI1640培养基培养12 h，改用正常培养液培养。之后将细胞随机分为4组，分别为对照组和实验1、2、3组，各组每孔分别加入“1.2”中获得的浓度从低到高的药物血清各20 μL。

1.4 SMMC-7721细胞形态观察及增殖率测算 分别于加药物血清24、48 h后收集各组细胞，弃掉上清液，PBS缓冲液冲洗2次。倒置显微镜下观察细胞形态变化，采集图像；每孔加入MTT溶液10 μL，分光光度计450 nm波长处检测各孔光密度(OD)值，同时设一不含细胞的空白调零组，仅加入同等浓度的MTT溶液及无药物血清的培养液，实验重复3次，计算细胞增殖率。

1.5 SMMC-7721细胞凋亡情况观察及凋亡率测算 于加药物血清48 h后收集各组细胞，弃掉上清液，PBS缓冲液冲洗2次，以AO溶液和EB溶液按照1∶1混合成工作液，分别加入工作液1 mL，必须充分覆盖细胞，置于荧光显微镜下观察SMMC-7721细胞的凋亡形态，采集图像。各组给药48 h后弃上清液，胰酶消化后收集细胞，PBS缓冲液冲洗2次，计数并调整细胞浓度，使每0.1 mL含有(1～5)×105个细胞，400 μL结合缓冲液悬浮细胞，加入Annexin V-FITC、PI各10 μL，混匀后室温避光10 min，流式细胞仪测算细胞凋亡率。

1.6 SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax蛋白检测 将各组细胞以3×105/孔接种于6孔板中，每孔2 mL。待细胞贴壁后给予不同浓度的药物血清处理48 h，用含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解30 min，震荡30 s。经4 ℃、3 000 r/min离心20 min后，BCA法测定蛋白浓度，100 ℃变性10 min。在15%的SDS-PAGE分离胶、5%浓缩胶电泳2 h，转膜、封闭1 h，Bcl-2、Bax抗体置于4 ℃冰箱中孵育过夜，再经二抗常温下孵育1.5 h，显影。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2 结果

2.1 各组SMMC-7721细胞形态 倒置显微镜下观察，实验1、2、3组给药48 h后，细胞发生变性、坏死，数量减少，细胞体积增大，细胞排列稀疏，随着药物血清浓度的增加，细胞坏死程度也加重。见图1。

图1 各组给药24、48 h后SMMC-7721细胞形态

2.2 各组SMMC-7721细胞增殖情况比较 给药24、48 h后实验1、2、3组OD值和细胞增殖率均低于对照组，且实验3组OD值和细胞增殖率低于实验1组(P均<0.05)。实验1、2、3组给药48 h后OD值和细胞增殖率低于同组给药后24 h(P均<0.05)。详见表1。

表1 给药后不同时间各组SMMC-7721细胞OD值与增殖率比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与实验1组比较，#P<0.05。

2.3 各组SMMC-7721细胞凋亡情况及凋亡率比较 给药48 h后，实验1、2、3组细胞发生凋亡，细胞核染色为橘红色并呈固缩状、团块状结构，细胞由圆形变为梭形(图2)。给药48 h后实验1、2、3组和对照组凋亡率分别为29.68%±1.17%、31.97%±3.36%、35.45%±3.96%、0.08%±0.03%，实验1、2、3组细胞凋亡率均高于对照组(P均<0.05)。

2.4 各组SMMC-7721细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达比较 给药48 h后实验1、2、3组和对照组细胞中Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.93±0.02、0.68±0.04、0.63±0.05、0.97±0.01，Bax蛋白相对表达量分别为0.28±0.01、0.33±0.09、0.35±0.05、0.25±0.04。与对照组相比，实验1、2、3组Bcl-2蛋白表达量降低，Bax蛋白表达量增高(P均<0.05)；与实验1组相比，实验3组Bcl-2蛋白表达量降低，Bax蛋白表达量增高(P均<0.05)。

图2 各组SMMC-7721细胞凋亡形态

3 讨论

在肿瘤相关性死亡中肝癌仅次于肺癌和胃癌，居于第3位[7]。肝癌具有起病隐匿、进展快、恶性程度高的特点，目前没有有效的治愈手段，患者预后较差。中医药疗法对改善术后或放化疗后肝癌患者的生活质量有积极意义，尤其对于晚期肝癌患者，中医药疗法能尽可能地让患者在治疗中受益。研究证实，IGBR有增强机体免疫力、保护肝脏、诱导肝脏清除自由基、抑制脂质过氧化和抗肿瘤等作用等，具有广泛的药理活性[8，9]。

细胞凋亡是程序性死亡过程，调控机体发育和内环境稳定[10，11]。大量研究结果表明，凋亡基因在肿瘤细胞和实体肿瘤中均表达异常。细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡状态被打破，导致肿瘤不受控制的生长，是肿瘤发生发展的重要因素之一[12，13]。正常的凋亡减弱，才使得肝癌的生长能够躲避机体免疫系统的监视，加速细胞增生。大量研究数据表明，中草药治疗肝癌有不同程度地促进肝癌细胞凋亡的效果[14]。本研究结果显示，实验1、2、3组给药48 h后，细胞发生变性、坏死。给药24、48 h后实验1、2、3组OD值和细胞增殖率均低于对照组，且实验3组低于实验1组。实验1、2、3组给药48 h后OD值和细胞增殖率低于同组给药后24 h。给药48 h后，实验1、2、3组细胞呈凋亡形态；实验1、2、3组细胞凋亡率均高于对照组。上述结果表明，IGBR有抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡的作用，且药物浓度越高，作用越明显。

凋亡相关蛋白(如Bcl-2、Bax)表达调节在细胞凋亡中发挥了关键作用。正常情况下，凋亡相关蛋白表达处于相对稳定的状态；当细胞恶变时，凋亡蛋白表达失衡，诱导细胞凋亡抑制，细胞恶性增殖。Bcl-2作为原癌基因，可通过调控凋亡信号的表达来发挥抑制凋亡作用，其与细胞异常增殖有关，与肝癌的发生紧密相关[15，16]。抑癌基因Bax的作用与Bcl-2相反，能够与Bcl-2形成异二聚体或同二聚体，诱导细胞凋亡，Bcl-2/Bax值也是决定细胞凋亡抑制作用强弱的关键[17]。当Bcl-2高表达时，Bcl-2/Bax比例升高，抑制凋亡能力增强，促使肿瘤细胞的增殖；反之则抑制了Bcl-2的抗凋亡作用，加速细胞凋亡[18]。研究[19]发现，半枝莲提取物能够诱导SMMC-7721细胞凋亡，用药组肝癌细胞中Bcl-2表达减弱；山豆根提取物也可以使肝癌细胞Hep3B加速凋亡，可显著增强Bax表达并抑制Bcl-2表达。本研究发现，与对照组相比，实验1、2、3组Bcl-2蛋白表达量降低，Bax蛋白表达量增高；与实验1组相比，实验3组Bcl-2蛋白表达量降低，Bax蛋白表达量增高。这表明IGBR药物血清可下调肝癌细胞中Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，这可能是IGBR抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的机制。

综上所述，含IGBR的大鼠血清可抑制SMMC-7721细胞增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能与Bcl-2蛋白表达下调、Bax蛋白表达增高有关。本研究结果为今后草苁蓉的抗肿瘤应用提供了理论基础。

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