鱼腥草水提液及其主要成分体外对71型肠道病毒的抑制作用观察

张慧锋，郭淑英，马莹慧，庄艳，于欢

(1吉林医药学院，吉林吉林132013；2吉林大学生命科学学院；3齐鲁医药学院)

手足口病是近年来严重影响婴幼儿健康的一种传染病，该病是由多种肠道病毒引发的婴幼儿急性传染病[1]，其中最为常见的病原体是肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)[2]。EV71感染易出现神经系统损害[3]，常引起重症甚至导致死亡[4]，因此许多研究者开展抗EV71感染研究[5～8]，以期实现对EV71感染所致手足口病的预防和治疗，降低手足口病危重症的发生率。传统中草药具有价格低廉、广谱抗病毒等许多优点[9]，其中很多中药单体已被发现具有良好的抗EV71作用[10～12]，但中草药口感较差，且部分具有肾毒性，在5岁以下患儿的预防和治疗应用中受到巨大限制。鱼腥草为三白草科植物蕺菜的新鲜全草或干燥地上部分，具有清热解毒等功能[13]。现有研究[14～17]表明鱼腥草对一些病毒具有抑制作用，且其为药食两用植物，婴幼儿服用毒性作用小。为此，本研究观察了鱼腥草水提液及其主要成分绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素体外抗EV71的作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞及主要实验材料 EV71采集于哈尔滨市儿童医院，经real-time PCR检测为EV71阳性的样本开展病毒分离，经real-time PCR检测确认。RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞，由吉林大学馈赠，本实验室传代培养，最大代数为21代。鱼腥草采购于吉林大药房(太极集团四川锦阳制药有限公司，批号Z51020213)，经鉴定为三白草科植物蕺菜的干燥地上部分。绿原酸、芦丁、金丝桃苷和槲皮素购自上海绿源生物有限公司(批号分别为R2015032、T2015141、W2015083、S2015168)，纯度经黑龙江省食品药品检验所中药室测定分别为99.68%、98.59%、98.36%和99.15%。主要试剂包括核酸提取试剂盒(QIAGEN 74104)、MEM(GIBCO 4500-034)、胎牛血清(Hyclone sr30087.02)、EDTA-胰酶(GIBCO 25200)、PBS(GIBCO 10010)、二甲基亚砜(Sigma D5879)、MTT(Amresco 0793)、手足口real-time PCR检测试剂盒(江苏硕世生物科技有限公司)。主要仪器包括核酸提取仪(德国QIAGEN公司QIAcube)、荧光定量PCR仪(美国 ABI 7500)、CO2培养箱(日本SANYO MCO-15A)、倒置显微镜(日本Nikon TE2000-5)。

1.2 药液配置及其细胞毒性检测 ①病毒增殖和感染性的测定：按参考文献[18]开展实验并测定病毒的TCID50=1.52×10-5/0.1 mL。②药液配置：鱼腥草药液采用索氏提取器沸水浴中进行恒温浸提2 h，减压抽滤，滤液过0.2 μm滤膜，定容至250 mL，则所得溶液当量为50 mg/mL生药，4 ℃保存备用；金丝桃苷药液和绿原酸药液以两药各20 mg分别加入到0.2 mL的DMSO和4.8 mL的5%胎牛血清细胞培养液组成的稀释液中，药液浓度为4 mg/mL，4 ℃保存备用；槲皮素药液和芦丁药液以两药各100 mg，加入到0.25 mL的DMSO和4.75 mL的5 %胎牛血清细胞培养液组成的稀释液中，药液浓度为20 mg/mL，4 ℃保存备用。③药液细胞毒性检测：将配置好的上述药液用细胞培养液对倍稀释5个稀释度，接种于准备好的RD细胞上，每个稀释度设4孔，同时设不加药液的正常细胞为对照，每日观察细胞病变，连续7 d观察药物毒性，细胞出现病变者判为存在毒性。结果显示各种药液实验浓度对RD细胞均无细胞毒性作用，可用于后续实验。

1.3 鱼腥草水提液及其主要成分抗EV71作用观察 将RD细胞分为鱼腥草组、金丝桃苷组、槲皮素组、芦丁组、绿原酸组、对照组。鱼腥草组分别给予5 000、2 500、1 250、625、313 mg/L的鱼腥草水提液；槲皮素组加入槲皮素药液，芦丁组加入芦丁药液，药液浓度分别为10.00、5.00、2.50、1.25、0.63 mg/mL；金丝桃苷组加入金丝桃苷药液，绿原酸组加入绿原酸药液，药液浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL；对照组加入细胞培养液。

表1 鱼腥草水提液及其主要成分对EV71的复制抑制作用、生长阻滞作用、抗吸附作用、灭活作用结果

1.3.1 病毒复制抑制作用观察 取100 TCID50的EV71病毒液感染形成单层的RD细胞，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h后弃病毒液，用PBS洗单层细胞，将感染EV71的RD细胞分为6个组，各组给药方法参考“1.3”，给药后培养1～3 d，观察细胞病变(CPE)。采用MTT法测算病毒复制抑制率[19]。以药品浓度为横坐标，病毒复制抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率对应的药液浓度即为IC50。

1.3.2 病毒生长阻滞作用观察 将RD单层细胞分为6个组，分组及给药方法参考“1.3”，培养3 d后弃培养液，PBS清洗2次后加100 TCID50的EV71病毒液100 μL接种，37 ℃孵育1 h，用PBS清洗以去除未吸附的病毒，加入含0.5%胎牛血清的细胞维持液，培养1～3 d，逐日观察CPE。生长阻滞率=[(A490测试孔-A病毒对照)/(A490细胞对照-A490病毒对照)]×100%。

1.3.3 抗病毒吸附作用观察 将RD单层细胞分为6个组，根据“1.3”方法分别将不同药物浓度培养液分别接入已长满单层细胞的96孔板内，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h后弃药液，接入100 TCID50的EV71病毒液100 μL，37 ℃孵育2 h。用PBS洗单层细胞，去除未吸附的病毒和中药成分，加入含0.5 %胎牛血清的细胞维持液，培养1～3 d，观察CPE。吸附抑制率=[(A490测试孔-A病毒对照)/(A490细胞对照-A490病毒对照)]×100%。

1.3.4 灭活病毒作用观察 取100 TCID50的EV71病毒液与不同药物浓度培养液等体积混合，37 ℃作用90 min，然后4 ℃ 13 000 r/min离心5 min，去除中药成分，沉淀用PBS洗涤后再4 ℃ 13 000 r/min离心10 min。病毒沉淀以DMEM培养液重悬，接种至单层RD细胞上，培养1～3 d，观察CPE。灭活率=[(A490测试孔-A病毒对照)/(A490细胞对照-A490病毒对照)]×100%。

1.3.5 抗病毒穿入作用观察 将单层的RD细胞接种100 TCID50的EV71病毒液100 μL，4 ℃下吸附1 h，用PBS洗单层细胞，去除未吸附的病毒。将吸附病毒的细胞分为6个组，各组按“1.3”方法加入不同浓度药液37 ℃培养15、30、60 min，加入蛋白酶K反应20 min，用1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)终止反应，用PBS洗单层细胞2次，加入含0.5 %胎牛血清的细胞维持液，培养1～3 d，观察CPE。穿入抑制率=[(A490测试孔-A病毒对照)/(A490细胞对照-A490病毒对照)]×100%。

2 结果

鱼腥草水提液及主要成分绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素体对EV71的抗病毒作用结果见表1、2。由表1可知，鱼腥草组、槲皮素组病毒复制抑制率高于其余四组，且药物作用浓度越高，抑制作用越强(P均<0.05)；金丝桃苷组和芦丁组病毒生长阻滞抑制率高于其余四组(P均<0.05)；金丝桃苷组、鱼腥草组病毒吸附抑制率高于其余四组(P均<0.05)。鱼腥草具有一定的病毒复制抑制作用和较弱的抗病毒吸附作用，IC50为3.22 g/L。金丝桃苷具有较弱的病毒生长阻滞作用和抗病毒吸附作用。槲皮素具有一定的病毒复制抑制作用，IC50为0.403 mg/mL。芦丁具有较弱的病毒生长阻滞作用。鱼腥草水提液及其主要成分均没有灭活病毒的作用。

药物作用15、30、60 min时各组CPE均为++++。由表2可以看出，各组在作用15、30 min时均未表现出对病毒穿入的抑制作用。在作用60 min时，鱼腥草组、槲皮素组、芦丁组、绿原酸组病毒穿入抑制率高于金丝桃苷组和对照组(P均<0.05)。鱼腥草、槲皮素、芦丁、绿原酸对EV71均有不同程度的穿入抑制作用。鱼腥草对EV71穿入的抑制作用受浓度变化影响不明显；槲皮素和芦丁的作用随药物浓度降低而减弱；绿原酸的作用随着浓度降低而增强。

表2 鱼腥草水提液及其主要成分抗EV71病毒穿入作用结果

3 讨论

手足口病为婴幼儿传染病，危重症患者多为EV71型病毒感染。本研究期望在药食两种植物鱼腥草中，找到对EV71有抑制作用的成分，在EV71感染所致手足口病的预防和治疗中得以应用。

通过研究发现，鱼腥草具有抑制EV71病毒复制的作用，金丝桃苷、芦丁、绿原酸没有表现出这种作用，而槲皮素却表现出这种作用。槲皮素为非水溶性物质，因此可能是其他物质在鱼腥草水提液中起作用或槲皮素转化的结构类似产物起作用。据文献报道鱼腥草中槲皮素含量为2.11～4.65 mg/g[20，21]。如果是槲皮素结构类似转化产物起作用，根据槲皮素含量推算，鱼腥草的IC50应为87～191 g/L，而本实验结果中鱼腥草IC50为3.22 g/L，值较小，因此推断是鱼腥草水提液中其他物质具有抑制EV71复制的作用，或槲皮素转化的结构类似产物作用增强。

鱼腥草没有显现出对EV71病毒生长的阻滞作用，而金丝桃苷和芦丁有较弱的生长阻滞作用。我们考虑鱼腥草组结果出现的原因可能与用量有关。据文献报道，鱼腥草中金丝桃苷含量为1.5～5.7 mg/g[21，22]，实验用鱼腥草组最大金丝桃苷含量为0.007 5～0.028 5 mg/mL，远远低于金丝桃苷组最低浓度0.25 mg/mL，因此可能是鱼腥草组中金丝桃苷含量比较低，所以鱼腥草组未能表现出对EV71的生长阻滞作用。同时，文献报道鱼腥草中芦丁的含量为1.44～9.31 mg/g[23～25]，实验用鱼腥草组最大芦丁含量为0.007 2～0.046 5 mg/mL，远远低于芦丁组最低浓度1.25 mg/mL，同样可能因为鱼腥草组中芦丁含量比较低，导致鱼腥草组出现阴性结果。因此可以推断金丝桃苷和芦丁具有对EV71的生长阻滞作用。

本研究结果显示，鱼腥草具有抗EV71吸附作用，金丝桃苷组同样具有较弱的抗病毒吸附作用，而其他组别均无此作用；且金丝桃苷组的抗病毒吸附作用效果强于鱼腥草组，推测作用差异与用量有关。

在本研究中，鱼腥草水提液及其主要成分均未表现出灭活EV71的作用，说明鱼腥草不具有灭活EV71的作用。作用60 min时鱼腥草组表现出较弱的抗EV71穿入作用，同时槲皮素组、芦丁组、绿原酸组也有抗EV71穿入作用；槲皮素组和芦丁组的作用随浓度降低而减弱，但绿原酸组该作用随着浓度降低而增强，鱼腥草组的作用随浓度变化不明显，可能是槲皮素、芦丁、绿原酸等多种物质共同作用的结果。各组药物作用15、30 min时均未表现出抗EV71穿入作用，说明该作用的发挥需要一定时间。

总之，上述研究结果为鱼腥草水提液及其有效成分抗EV71的临床应用提供了实验数据。然而，中草药的功效可能是多种成分共同作用的结果，同时由于药物含量不同，因此整体功效与单一组分存在差异。我们认为，鱼腥草的抗病毒作用可能是通过多成分、多靶点、多机制共同作用的结果，应根据不同的目的开展更加深入的研究，以获得更好功效的成分配比。

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