中国汉族家系痛风患者β3肾上腺素受体基因突变观察

孙雅奇，刘世国，贺玉伟，李长贵

(青岛大学附属医院，山东青岛266071)

痛风是长期嘌呤代谢障碍、血尿酸增高引起组织损伤的一组异质性疾病，以剧烈疼痛、急慢性关节炎、痛风石为临床特征[1]。遗传因素是痛风发病的关键因素[2]。研究[3]表明，10%～30%的原发性痛风患者有痛风家族史，家系痛风(除先证者外，该家系三代以内直系亲属还有1例及以上痛风患者)与散发痛风在遗传机制上存在差异，但目前相关研究多基于散发病例，国内外关于家系痛风易感基因的研究较少。β3肾上腺素受体(ADRB3)主要表达于脂肪组织[4]，多种族大量人群的横断面研究与病例对照试验均提示ADRB3基因是高尿酸血症和痛风形成的易感基因[5～8]。但是目前国内外开展的ADRB3基因与痛风和高尿酸血症遗传易感性的研究中，研究对象均为散发痛风患者。为明确ADRB3基因与家系痛风遗传易感性的关系，本课题组对中国汉族家系痛风患者进行ADRB3基因突变筛查。

1 资料与方法

1.1 研究对象 在山东省痛风病临床医学中心已建立的痛风遗传资源库中，收集500例来自不同家系的家系痛风先证者(病例组)及500例与痛风家系无关的正常人(对照组)。以上人群均接受内分泌代谢病专科医生的病史采集和体格检查，检测所有研究对象的空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇及血尿酸等指标。痛风诊断均符合美国风湿病协会(ACR)诊断标准和2015ACR/EULAR制订的痛风分类诊断标准[9,10]。500例正常对照纳入标准为：血尿酸水平<360 μmol/L；无痛风发作史；与痛风家系无关；排除影响尿酸代谢及排泄的疾病如血液系统疾病、慢性肾病、高血压等；排除应用影响尿酸水平的药物如氢氯噻嗪、阿司匹林、替米沙坦等。两组研究对象均为中国汉族人群。本研究已获青岛大学医学院医学伦理委员会审批通过。所有参与者已知晓本研究的相关情况，并签署知情同意书。

1.2 ADRB3基因突变筛查方法 采用DNA提取标准试剂盒提取两组外周血基因组DNA。用Nanodrop超微量分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度。采用Primer5.0软件设计引物扩增ADRB3所有外显子，由上海英潍捷基公司合成引物，引物序列见表1。PCR反应体系及扩增条件参考文献[11]。将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用Bio-Rad凝胶成像仪进行图像扫描，于相应位置处可见单一清晰条带。PCR产物送至北京擎科生物有限公司进行直接测序。采用Chromas2.21软件查看峰图文件。以GenBank中ADRB3基因外显子序列(NM000025.2)为参照序列，用DNAMAN软件对序列进行比对分析。所有突变位点均进行反向测序验证。将发现的突变位点在常用基因变异数据库(dbSNP、1000genomics、ESP6500、UniProt、ClinVar)中进行比对。新发突变按照HGVS国际规范进行命名[12]。

表1 ADRB3基因外显子片段引物序列

1.3 ADRB3基因突变先证者家系调查 对携带ADRB3基因突变的家系痛风先证者所在家系成员进行调查。家系中三代以内直系亲属均接受内分泌代谢病专科医生的病史采集、体格检查、外周血样本采集和血生化检查。家系外周血样本均提取DNA，进行PCR扩增，对ADRB3基因外显子测序并分析。

2 结果

2例家系痛风先证者ADRB3基因3′-非翻译区(UTR)存在杂合突变c.*660C>T，即ADRB3基因3′-UTR第660位碱基存在C>T的杂合性突变。该突变在对照组中不存在，常用基因变异数据库如dbSNP、1000genomics、ESP6500、UniProt、ClinVar中未发现此突变，国内外研究也未见报道，为新发突变。基因突变及正常测序峰图见图1。

1例携带ADRB3 c.*660C>T突变的先证者所属家系共11例家系成员中，5例为痛风患者。通过家系系谱图(图2)分析该家系痛风的遗传特征：每代均有痛风患者，父母中有痛风患者则子女有50%概率发病，父母中无痛风患者则子女无人患病。男女发病机会均等，该家系痛风符合常染色体显性遗传。该家系中5例痛风患者均携带ADRB3 c.*660C>T突变，而非痛风患者不携带此突变，基因型与表型共分离。5例痛风患者测序峰图见图3。该家系痛风患者临床资料见表2。Ⅲ2为先证者，20岁，18岁发病，血尿酸665 μmol/L(正常值为<420 μmol/L)，首发关节为足背部，并累及第一跖趾关节和踝关节；查体身高192 cm，体质量110 kg，BMI 29.8 kg/m2；血压、空腹血糖、甘油三酯、胆固醇均未发现异常。所有痛风患者血尿酸498～694(595±75)μmol/L，明显高于正常。非痛风患者血尿酸水平正常。5例痛风患者查体BMI (27.9±1.7)kg/m2、空腹血糖(7.1±0.9)mmol/L、甘油三酯(3.28±1.77)mmol/L、血胆固醇(5.21±0.81)mmol/L，其中合并肥胖、糖尿病、高血压各3例。见表2。

另外1例携带ADRB3 c.*660C>T突变的先证者37岁，就诊时首次发病，第一跖趾关节疼痛、肿胀、关节发红，血尿酸434 μmol/L；所属家系中仅其祖父为痛风患者，已去世，未获得其血液样本；该家系其他成员拒绝参加本研究。

注：A、B分别为2例家系痛风先证者ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T峰图，箭头所指处为杂合突变；C为不携带该突变的正常对照测序峰图，箭头所示无突变。

图12例家系痛风先证者ADRB3基因3′-UTR杂合突变示意图

图2 携带ADRB3 c.*660C>T突变的痛风家系系谱图(箭头所指为先证者)

注：箭头所指为ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T。

图3携带ADRB3c.*660C>T突变的1例痛风家系中5例痛风患者ADRB3基因突变示意图

3 讨论

痛风是多基因遗传病，其发病是环境因素与多个易感基因共同作用的结果[13]。多项研究显示ADRB3基因是高尿酸血症和痛风形成的易感基因[5～8]。Wang等[5]对中国汉族男性421例痛风患者和312例正常人进行病例对照研究，结果显示rs4994(Trp64Arg)位点与中国汉族男性痛风呈强相关，Arg64等位基因携带者患痛风的风险显著增加，提示ADRB3基因是中国汉族男性痛风的易感基因。有学者[7]对新西兰人群进行研究发现，ADRB3基因rs4994(Trp64Arg)位点在校正肾脏疾病的影响后与痛风存在关联性。Huang等[6]发现rs4994(Trp64Arg)位点与高尿酸血症呈强相关，Arg64等位基因携带者患高尿酸血症的风险显著增加。但以上研究对象均为散发痛风患者。目前国内外未见ADRB3基因与家系痛风遗传易感性之间的报道。

表2 携带ADRB3 c.*660C>T突变的1例痛风家系中5例痛风患者临床资料

本研究选择山东省痛风病临床医学中心痛风遗传资源库收集的500例来自不同家系的家系痛风先证者，以及500例与以上家系无关的正常对照，选择中国汉族原发性痛风易感基因ADRB3外显子进行测序，发现2例家系痛风先证者存在ADRB3基因3′-UTR新发突变c.*660C>T。其中一个家系共三代11人，包括5例患者(男4例、女1例)，6例正常人。5例患者均携带ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T，而正常人不携带。该痛风家系具有自己的遗传特点：每代均有痛风患者，男女发病机会均等。痛风好发于男性，发病高峰年龄在40～50岁[14]，而该家系平均发病年龄(31±11)岁，比散发患者发病早近10岁。第一代中Ⅰ1发病年龄50岁，第二代中Ⅱ1、Ⅱ3发病年龄分别为35、31岁，第三代中Ⅲ1、Ⅲ2发病年龄分别为22、18岁，每一代痛风患者发病年龄均比上一代提前。临床研究发现，95%痛风患者是男性，女性发病多在绝经期后，而女性患者Ⅱ3发病时31岁，属绝经期前发病[14]。综上，该家系是典型的常染色体显性遗传家系，基因型与表型共分离，呈现遗传早现现象，可能为单基因遗传模式，新发罕见ADRB3 c.*660C>T突变可能是该家系的致病突变。

人ADRB3基因位于染色体8p12-p11.2，全长3 672 bp，3′端非编码区共1 224 bp[3]。Traget Scan和PicTar软件预测有11种miRNA能与ADRB3基因3′-UTR结合，即let-7d-5p、let-7g-5p、let-7e-5p、miR-98-5p、let-7i-5p、miR-4500、let-7b-5p、let-7a-5p、let-7f-5p、let-7c-5p。ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T并不位于上述11种miRNA与ADRB3基因3′-UTR的结合区域内，推测c.*660C>T突变可能通过影响miRNA与ADRB3基因3′-UTR结合或结合后形成空间构象从而导致ADRB3基因异常表达[15]。功能研究证实，β3肾上腺素受体功能下降可引起脂肪组织中脂肪分解减少和脂肪酸氧化下降，导致脂肪沉积、血游离脂肪酸升高、脂肪细胞分泌TNF-α增多，导致肥胖、胰岛素抵抗[16]。在胰岛素抵抗状态下，3-磷酸甘油脱氢酶活性降低，糖酵解过程的中间产物向5-磷酸核糖及磷酸核糖焦磷酸转移，导致血尿酸生成增多[17]。此外，胰岛素抵抗状态可引起继发性高胰岛素血症，高水平的胰岛素及胰岛素前体物可刺激肾小管Na+-H+交换，增加H+排泌的同时使尿酸重吸收增多；还可以通过影响近端肾小管尿钠排泄而竞争性抑制尿酸的排泄，使血尿酸升高，从而引起痛风性关节炎的发生[18]。本研究中，5例携带ADRB3基因c.*660C>T突变的家系痛风患者中合并肥胖、糖尿病各3例，血生化检查空腹血糖、甘油三酯、胆固醇水平高于正常。结合基因型与表型，我们推测ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T可能影响miRNA与ADRB3基因3′-UTR结合，形成空间构象，导致β3肾上腺素受体功能下降，出现肥胖、胰岛素抵抗，影响肾尿酸排泄进而导致高尿酸血症，引起痛风性关节炎。

综上，本研究发现2个中国汉族原发性痛风家系中存在ADRB3基因3′-UTR新发杂合突变c.*660C>T。该突变可能是其中一个家系的致病突变，但具体致病机制还需进一步研究。

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