缺氧诱导因子抑制剂YC-1对缺氧肝癌细胞生物钟基因和蛋白表达及增殖的影响

许静，孙诚谊，喻超，何晓晓，杨盛力

(1贵州医科大学附属医院，贵阳550000；2华中科技大学同济医学院附属梨园医院；3华中科技大学同济医学院附属协和医院)

生物钟是生物体生命活动的内在节律，在长远的进化过程中已趋于稳定。生物钟主要由Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε、Clock、BMAL1、NPAS2和Rev-Erbα等基因调控[1，2]。生物钟基因表达异常可导致生物节律紊乱，影响细胞生长、代谢和损伤修复，并在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[3]。如Per1、Per2、Per3、Bmal1等通过诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤的发生；Clock则促进肿瘤的侵袭与转移[4～7]。肿瘤最突出的特性之一即生长快速，随着细胞数量、体积的快速增加，肿瘤内部的血液供应相对不足，形成缺氧微环境[8，9]。缺氧信号通路阻断剂YC-1由人工合成，可抑制低氧诱导因子1(HIF-1)的表达，并抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达，从而发挥抗肿瘤的作用[10～12]。在肿瘤组织中，普遍存在着生物钟基因表达异常。肝细胞癌的发生、发展与生物钟表达紊乱亦关系密切[13]。然而目前对于生物钟基因表达变化与肝癌发生发展的具体机制尚不明确。我们前期研究发现缺氧微环境可引起肝癌细胞中生物钟基因表达紊乱[14]。本研究中，我们将通过三气培养箱模拟体内缺氧微环境，观察YC-1对缺氧肝癌细胞中生物钟基因、蛋白表达及细胞增殖的影响，进一步探索生物钟基因在肝癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清购于美国Hyclone公司。PCR引物购于Invitrogen公司。RNA提取试剂TRIzol、PCR试剂SYBR Green PCR Master Mix及PCR引物合成由Life公司提供。鼠抗人Cry1单克隆抗体、兔抗人Cry2多克隆抗体、兔抗人Clock多克隆抗体、兔抗人Bmal1多克隆抗体均购于Abcam公司。鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司。鼠抗人Per1、Per2、Per3多克隆抗体由Novus公司提供。

1.2 YC-1对缺氧肝癌细胞生物钟基因和蛋白表达的影响观察

1.2.1 Huh7细胞培养与分组 将肝癌细胞Huh7接种于6孔板中，置于缺氧培养箱中，按氧气1%、氮气74%、二氧化碳25%的比例持续通入气体，待Huh7细胞生长至75%融合时，将细胞分为实验组和对照组，分别加入等量的DMSO和50 μmol/L的YC-1。

1.2.2 Huh7细胞中生物钟基因检测 采用real-time PCR法检测两组细胞中的Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1 mRNA。两组于培养48 h后用TRIzol试剂提取出RNA，测量提取RNA的浓度及纯度，取等量RNA并逆转录为cDNA，根据试剂盒说明书进行定量PCR反应，每个反应设3个复孔。PCR总反应体系为20 μL，包括SYBR Green Mix 10 μL、cDNA模板1.5 μL、10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL、ddH2O 6.5 μL。以β-actin为内参。生物钟基因及内参基因引物序列见表1。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

表1 生物钟基因及内参基因引物序列

1.2.3 Huh7细胞中生物钟基因蛋白检测 采用Western blotting法检测两组细胞中的Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1蛋白。提取两组细胞总蛋白，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到PVDF膜上，封闭2 h后，孵育一抗、二抗，ECL法显色，计算机扫描蛋白质条带后进行灰度分析。以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

监测点的布设是环境监测质量保证过程中最为关键的基础环节，决定了样品的代表性。大气监测样点在污染源分散的情况下，采用网格布点法、功能区布点法、同心圆布点法或扇形布点法等。在实际工作中，为达到因地制宜，往往采取以一种布点方法为主，兼用其他方法的综合布点法。对于某一河段的监测，一般只需设置对照、控制和消解三种断面，再根据水面的深度和宽度确定具体的采样点。例如，当水面宽度不大于50 m时，只设一个中泓垂线；在一条垂线上，当水深不大于5 m时，只在水面下0.5 m处设一个采样点。

[14] Bhatti P, Cushing-Haugen KL, Wicklund KG, et al. Nightshift work and risk of ovarian cancer[J]. Occup Environ Med, 2013,70(4):231-237.

2 结果

2.1 两组细胞中生物钟基因表达比较 实验组细胞中Clock、Per1、Per3、Cry1 mRNA相对表达量低于对照组，Bmal1、Per2、Cry2 mRNA相对表达量高于对照组(P均<0.05)。详见表2。

表2 两组细胞中生物钟基因表达比较

2.2 两组细胞中生物钟基因蛋白表达比较 实验组细胞中Clock、Per1、Per3、Cry1蛋白相对表达量低于对照组，Bmal1、Per2、Cry2蛋白相对表达量高于对照组(P均<0.05)。详见表3、图1。

表3 两组细胞中生物钟基因蛋白表达比较

图1 两组细胞中Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1蛋白表达情况

2.3 两组细胞克隆形成情况比较 实验组克隆形成个数为83个、克隆形成率为27.67%，对照组分别为191个、63.67%，实验组克隆形成个数及克隆形成率均低于对照组(P均<0.05)。详见图2。

3 讨论

笔者结合微课有关特点，按照课堂教学内容与形式，分门别类将不同教学内容与微课进行整合，促进微课教学根植于课堂教学之中。

图2 两组细胞克隆形成情况

我们的前期研究发现，CoCl2诱导的缺氧条件可导致肝癌细胞中生物钟基因表达改变，表明缺氧可导致生物钟基因表达异常[18]。YC-1由人工合成，是HIF-1α的阻滞剂，其作用机制是抑制HIF-1α的表达并诱导缺氧依赖性细胞的特异性凋亡，同时产生活性氧簇(ROS)，从而将无氧的糖酵解转化为有氧的氧化磷酸化；若加入葡萄糖和胰岛素，能使YC-1特异性诱导细胞凋亡时产生的ROS量增加，从而增强抑制肿瘤生长的功能[11，12]。

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参考文献：

结合上述研究结果，我们认为，YC-1作用后，缺氧环境下的肝癌细胞中Clock、Per1、Per3、Cry1基因及蛋白表达下调，Bmal1、Per2、Cry2基因及蛋白表达上调，细胞增殖和克隆形成能力减弱。YC-1虽然不能完全逆转缺氧对肝癌细胞中生物钟基因表达的影响，但其可抑制肝癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。借鉴YC-1联合低剂量胰岛素和葡萄糖增强抗肿瘤作用的研究成果[11,19,20]，可考虑寻找其他能影响肝癌细胞生物钟基因表达的因子，与YC-1协同作用，共同遏制肿瘤的生长。

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他给马云写信，倡议淘宝大学给宗教人士免费开课，并许诺自己将创造一个奇迹，“人生出一次家，是多么的重要。要把出家与还俗，看成是在淘宝上开店与关门一样简单与顺理成章。那么我们的人生就更容易看破放下。”

邢双双等[8]认为护理质量评价指标体系应覆盖临床常见病和多发病，应利于临床专科使用，应明确各个指标的界定标准。本研究指标体系包括15项安全及消毒隔离敏感指标，9项护理记录及评估敏感指标，12项医嘱执行及服务流程敏感指标，3项输血专项敏感指标，内容涵盖护理质量过程和结局，适宜各类病人使用及临床各护理单元的护理质量管理。

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为使研究结果更具严谨性，以及尽可能减少其他变量的影响，本研究所用的肝癌细胞均处于对数生长期，避免了部分细胞衰老等自身因素对基因表达的影响。本研究结果显示，实验组细胞中Clock、Per1、Per3、Cry1 mRNA及蛋白相对表达量低于对照组，Bmal1、Per2、Cry2 mRNA及蛋白相对表达量高于对照组，提示缺氧信号通路阻断剂YC-1仅能影响肝癌细胞由缺氧引起的部分生物钟基因的表达紊乱，而不能起到完全逆转的作用。为研究YC-1对肝癌细胞增殖的影响，我们进行了克隆形成实验，结果显示，经YC-1作用后，实验组克隆形成率明显降低，表明YC-1能够抑制肝癌细胞的增殖。然而克隆形成率只能宏观地显示细胞增殖的多与少，而不能解释影响细胞增殖的机制，这是本研究的局限所在。

富马酸喹硫平是一种新型二苯氧氮杂卓类的多种神经递质受体拮抗剂，对于5‐HT2、D1、D2、H1与α1受体均具有较高亲和力，主要用于精神分裂症、情感障碍和抑郁症的治疗，临床不良反应发生率较少，目前富马酸喹硫平已成为精神分裂症与双向情感障碍及抑郁症治疗的一线用药［1‐3］，中国精神分裂症防治指南（2007版）将其作为临床一线药物进行推荐。

随着科学的发展，生物钟逐渐走入人们的视野，其对昼夜节律的干扰、对内分泌性疾病的促进，以及在肿瘤发生与发展过程中的重要作用正逐步被发现。生命的生物节律离不开生物钟的调控，而生物钟在分子水平上受多个生物钟基因的共同影响，包括原癌基因、抑癌基因、细胞周期调控因子、血管生成相关基因和转移相关基因等，如Per1、Per2、Per3、Clock、Bmal1、Cry1、Cry2、NPAS2、CKIε、Tim、Rev-Erb、DEC等[1，2]。越来越多的临床数据表明，生物节律紊乱如夜间工作导致的昼夜节律紊乱，可使生物钟基因表达紊乱，从而引发各种肿瘤如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌等[14～17]。研究[2]表明，对比癌旁正常组织，肝癌组织中Bmal1、NPAS2、DEC1高表达，Per1、Per2、Per3、Cry2则呈低水平表达，说明生物钟基因的表达与肝癌密切相关。在肝癌组织中高表达而正常组织中低表达的基因可能为癌基因，在癌旁正常组织中高表达而癌组织中低表达的基因可能为抑癌基因，由此推测生物钟基因的表达影响肝癌的发生与发展。同时有研究[18]表明，肝癌细胞中生物钟基因的表达明显受环境含氧条件的影响，在缺氧与常氧条件下的表达结果截然不同，较常氧条件，缺氧时Per1、Cry2、Bmal的表达水平升高，Cry1、Per2、Per3、CKIε、Clock的表达水平降低。但该变化趋势与生物钟基因在肝癌组织中的表达仅部分相同，表明还有其他因素影响肝癌的发生与发展。

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地名词典和测绘学叙词表都不能称之为地名本体，因为他们都是规范化的说明，专业性较强，而地名本体需要构建的是最广泛的，最基本的地名概念性内容，需要形式语言(Formal Language)的一般化描述。从使用目的上看，地名词典和测绘学叙词表都是检索工具，是为了方便信息的查询检索，而地名本体则是为了表达地名的知识体系，并不仅仅是规范概念，其所表达的属性内容较地名词典和叙词表更加丰富。

1.3 YC-1对缺氧肝癌细胞增殖的影响观察 取对数生长期的Huh7细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞后收集细胞，加入2个分别含10 mL预温培养基的培养皿中，并将密度调整至300/皿。将细胞分为实验组和对照组，实验组加入50 μmol/L的YC-1，对照组加入等量0.9%的NaCl溶液。在乏氧条件下(1% O2)培养细胞。当培养皿出现肉眼可见的克隆后，终止培养，弃上清，用PBS洗涤2次，并用5 mL的醋酸、甲醇液(1∶3)固定15 min，然后用Giemsa染色10 min。计数克隆数目，计算克隆形成率，克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

首先，东博会的品牌发展还不是特别成熟。近十多年来，随着南宁东博会的成功举办，南宁的会展业走上了一条高速发展的道路。但由于南宁经济底子薄，人才吸引力度薄弱，和其他省份相比，我们的会展业还不够成熟。东博会相比周边的广交会等大型展览会，实力相差较大，导致其吸引力不强，影响来参加展会的人员数量和质量，在一定程度上也影响其会展旅游以及南宁的整体旅游。

若图像中存在撒料区域，则使用区域生长算法对红外图像数据进行撒料区域分割，它将具有某种相似性质的像素或体集合起来构成区域.其基本思想是，在检测区域中设置一个种子作为生长种子，在种子周围搜索符合约束条件的种子，将其合并到种子点像素的集合.不断重复上述过程，直到没有符合约束条件的像素[13-14].其中约束条件是式8：

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(1) 梯度比Gr值测定。排水管淤塞试验在梯度比渗透仪上进行，其原理是通过测定渗透24 h后土工织物及其上25 mm厚土层的水力梯度i1以及土工织物上部25 mm至75 mm这段土层的水力梯度i2，按照下式求出梯度比Gr值：

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纤维素酶活力单位：在37℃，pH值5.5的条件下，每分钟从浓度为4 mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

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