萘酰亚胺接枝壳聚糖Al3+荧光探针的合成及光谱性能研究

2018-04-19谈光华王静静

发光学报 2018年4期

刘静, 谈光华, 张帆, 马静，王静静

(咸阳师范学院化学与化工学院, 陕西咸阳 712000)

1 引言

铝是地壳含量最丰富的金属元素，被广泛应用于航空、汽车等重工业，大量的使用同时也给环境和生物带来巨大的危害。如果人体摄入过量Al3+，可引起大脑神经的退化，记忆力衰退，甚至呈现老年性痴呆、肌萎缩型脊髓侧索硬化以及贫血等症状[1-2]，此外对植物的细胞活动、酶活性光合作用等生理活动也会造成不良影响。因此，对铝离子定量分析研究对于环境及生命科学都具有重大的意义。目前常用的测定方法有原子吸收、ICP-MS等,因其检测成本高、费时、样品前处理复杂等缺点使其应用受限。

近几年，荧光探针因敏感性高、选择性好、成本低、易于操作等优势成为检测金属离子的重要手段。与其他金属如铜离子、汞离子相比，关于铝离子的荧光探针报道相对较少。Wang等[3]报道了萘酰亚胺衍生物用于细胞渗透对Al3+识别；Yang[4]进一步应用该方法，实现了活细胞中同时对Al3+、Cr3+、Hg2+浓度的实时监测；Zhang等[5]以香豆素为母体合成的Al3+荧光传感器，荧光强度大大提高；姜秀娟等[6]以2-羟基-1-萘甲醛和邻苯二胺为原料，合成了在无水乙腈-水的混合溶液中快速有效地检测Al3+的荧光探针。戴雪芹等[7]以2-羟基萘甲醛，苯甲酰，联胺为原料，设计合成了一种用于检测Al3+的荧光传感器，但Cu2+和Fe3+会对检测有明显干扰，灵敏性有待提高。

1,8-萘酰亚胺类衍生物具有大的刚性结构、较高的荧光量子产率及萘环反应活性高且易被修饰等优势，常将其接枝不同的基团用于荧光探针中[8-9]。壳聚糖是一种亲水性、可降解性、再生性良好、易于进行接枝和改性的天然高分子[10]。本文报道了萘酰亚胺接枝环境友好天然壳聚糖，利用盐酸吗啉胍的富电子性和配位性，合成应用于环境中的Al3+检测的荧光探针，以期提高荧光探针的灵敏度、选择性。

2 实验

2.1 试剂与仪器

Specord 50 紫外分光光度计(德国Jena公司)；F-7000 荧光分光光度计(日本日立公司)；Nicoletis 50红外光谱仪(美国热电红外仪)；核磁共振波谱仪(AV-400瑞士布鲁克公司)。

4-溴-1,8-萘酐为阿拉丁试剂；壳聚糖、2-氯环丙烷、4-氨基苯酚、薄层色谱硅胶等均为分析纯。盐酸吗啉胍(山西太原药业有限公司，水中重结晶)。

2.2 荧光探针(NCFP)的合成

合成路线如图1所示。

图1 荧光探针的合成路线

将2.77 g(0.01 mol)4-溴-1,8-萘酐和少量无水乙醇置于装有搅拌和冷凝管三颈瓶中，N2保护，加入1.09 g(0.01 mol)4-氨基苯酚，回流下反应，TCL跟踪反应进程。反应结束后蒸出溶剂，加水析出灰色沉淀，水洗涤后乙醇重结晶，得暗灰色固体I，产率53%。

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.33 (s, 1H), 8.65-8.50 (m, 2H), 8.35 (d,J=7.5 Hz, 1H), 8.29 (d,J=7.7 Hz, 1H), 7.95 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.16 (d,J=7.5 Hz, 2H), 6.92 (d,J=7.5 Hz, 2H)。

IR(KBr)：3 458,3 055,2 908,2 849,1 640,1 573,1 435,1 348,1 242,781 cm-1。

将2.21 g(0.006 mol)化合物Ⅰ置于盛有40 mL乙二醇甲醚三颈瓶中，加入0.15 g(0.003 mol)NaOH和4.98 g(0.03 mol)KI作催化剂[11]，缓慢滴加0.65 g(0.007 mol)环氧氯丙烷的乙二醇甲醚溶液，60～65 ℃反应，TCL跟踪反应进程，反应结束后，过滤，粗产品水洗后用无水乙醇重结晶，40 ℃真空干燥，得到橘红色固体Ⅱ，产率37%。

1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ: 8.64～8.50 (m, 2H), 8.33 (d,J=7.6 Hz, 1H), 8.27 (d,J=7.6 Hz, 1H), 7.93 (t,J=7.6 Hz, 1H), 7.13 (d,J=7.6 Hz, 2H), 6.87 (d,J=7.6 Hz, 2H), 4.13 (t,J=7.3 Hz, 2H), 3.09～3.04 (m, 1H), 2.43 (t,J=7.1 Hz, 2H)。

IR(KBr)：3 123,2 989,2 854,1 681,1 595,1 449,1 349,1 260,791 cm-1。

取0.15 g(0.000 4 mol)化合物Ⅱ于盛有无水乙醇的三颈瓶，缓慢滴加0.5 g(0.000 2 mol)盐酸吗啉胍水溶液，回流，TCL跟踪反应进程，反应结束后旋转蒸发除去溶剂，丙酮重结晶，干燥得橘红色固体Ⅲ，产率32%。

1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.86(s, 1H), 8.63～8.51 (m, 2H), 8.47 (s, 2H), 8.35(d,J=7.6 Hz, 1H), 8.29(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.94 (t,J=7.6 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.14 (d,J=7.5 Hz, 2H), 6.92 (d,J=7.5 Hz, 2H), 4.87 (s, 1H), 4.12 (t,J=7.3 Hz, 2H), 3.59(t,J=7.2 Hz, 4H),3.13～3.08 (m, 1H),2.67 (t,J=7.2 Hz, 4H), 2.43 (t,J=7.1 Hz, 2H)。

IR(KBr)：3 453,3 418,3 233,3 116,2 977,2 867,1 686,1 588,1 439,1 355,1 246,778 cm-1。

将0.15 g(0.000 3 mol)化合物Ⅲ置于盛有DMSO的三颈瓶中，N2保护下，缓慢滴加0.1 g壳聚糖(DMSO溶解)溶胀液，85 ℃下反应，TCL跟踪反应进程，待反应结束，将淡橘黄色固体用氯仿经索氏抽提[12]，粘稠液在真空下干燥，得到淡黄色的粉末，即萘酰亚胺接枝壳聚糖荧光探针(NCFP)，产率39%。

1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.86 (s, 1H), 8.63～8.51 (m, 2H), 8.45 (s, 2H), 8.32(d,J=7.6 Hz, 1H),8.26 (d,J=7.8 Hz, 1H), 7.91 (t,J=7.8 Hz, 1H), 7.83(s, 1H), 7.72(s, 1H), 7.28(s, 1H), 7.11 (d,J=7.6 Hz, 2H), 6.87(d,J=7.6 Hz, 2H), 5.37～5.34(m, 4H), 4.85 (s, 1H), 4.25 (s, 1H), 4.10(t,J=7.2 Hz, 2H), 4.05～3.96(m, 1H), 3.59 (t,J=7.1 Hz, 4H), 3.50～3.44 (m, 5H), 2.67 (t,J=7.1 Hz, 4H), 2.59～2.52 (m, 1H), 2.40(t,J=7.0 Hz, 2H), 1.44～1.36 (m, 3H)。

IR(KBr):3 510,3 382,2 983,2 876,1 691,1 596,1 147,1 109,1 254,779 cm-1。

3 结果与讨论

3.1 荧光探针的光化学性能分析

实验考察了分别用乙醇、DMF、水、氯仿、丙酮、2%HAc水溶液，配制浓度为2×10-5mol/L的NCFP溶液并测对应的光化学性质(Ex=Em=5 nm)。

表1荧光探针在不同溶剂中的光化学性质测试结果

Tab.1 Photochemical data of the fluorescent probe in different solvent

荧光量子产率(ΦF)和荧光能量产率(EF)表征物质对光吸收和发射荧光的能力[13]。ΦF计算可通过比较硫酸奎宁(ΦF=0.55)的荧光光谱得到，其大小直接体现了荧光物质荧光发射能力;EF数值越大，说明跃迁过程中损失的能量越小。

3.2 NCFP对常见金属离子的选择性识别和竞争实验

为了确定NCFP对金属离子的识别性能，在2×10-5mol/L的NCFP(2%HAc)溶液中，测定分别加入等体积、等浓度常见金属离子(K+,Fe3+, Co2+,Cd2+,Hg2+,Cu2+,Ca2+,Cr3+,Pb2+,Zn2+,Ag+,Al3+)时的荧光强度。进一步通过测定上述溶液中分别等当量数的响应离子时荧光强度变化，考察其他共存金属离子对响应离子的干扰[15]。实验结果见图2。

图2 (a)NCFP对金属离子的响应；(b)Al3+与其他金属离子共存时的竞争试验。

Fig.2 (a) Fluorescence response of NCFP to different metal ions. (b) Effects on the fluorescent intensity of the probe coexistence with Al3+and other metal ions.

由图2(a)可知，未加金属离子前, NCFP本身荧光很弱，分别加入参与检测的金属离子K+、Fe3+、Co2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Ca2+、Cr3+、Pb2+、Zn2+、Ag+，均对其荧光强度没有显著影响。而Al3+加入后，在392 nm处荧光发射明显增强，远高于其他金属离子3～4倍。可见合成的NCFP 能够实现对Al3+的选择性识别。从图2(b)可以看出，在16 μmol/L其他金属离子存在条件下，再加入等当量数的Al3+，也会引起荧光强烈增强。这表明合成的探针NCFP对Al3+有专一的选择性，其他金属离子的存在不会影响Al3+的检测和识别。

3.3 温度、光照、pH值对NCFP-Al3+ 响应的影响

实验考查了温度、光照、不同pH值等因素对NCFP-Al3+荧光强度的影响。

由图3(a)、(b)可知，随着温度的升高和光照的进行，NCFP对Al3+的响应值呈现下降趋势，但下降幅度较小，分别约为-0.73/℃、-0.35/min。由于1.8萘酰亚胺荧光基团分子被牢牢地固定在壳聚糖壳大分子链上，使其刚性平面不易随着温度和光照进行而发生化学键旋转，可见合成探针表现出良好的耐光、耐热性能。由图3(c)可知，在 pH值为1～5范围内，NCFP对Al3+的响应值稳定在最高值；随着pH值继续增大，NCFP对Al3+的响应值表现出急剧下降趋势。强碱介质在 pH 值9～12范围内，响应值较之前下降近3倍。这是因为一方面合成的NCFP是以天然高分子壳聚糖为基体，易溶于酸性介质；另一方面当体系pH>9时，邻近萘酐的吗啉胍上氨基去质子化作用，将孤对电子传递给激发态的荧光团，减弱向Al3+提供孤对电子，表现为荧光强度降低。故在中性及碱性介质中，NCFP对Al3+的响应值很低。实验选择室温，pH=3～5(2%HAc配制所需溶液)。

图3 温度(a)、光照(b)、pH值(c)对NCFP-Al3+荧光强度的影响。

Fig.3 Effects of temperature(a), illumination(b) and pH (c) on fluorescent intensity of NCFP.

3.4 Al3+浓度对NCFP体系荧光强度的影响

实验考查在0～281.82 μmol/L之间，不同 Al3+浓度对NCFP荧光强度的影响。

由图4(a)可知：在392 nm处，随着Al3+浓度的增加，NCFP的荧光强度不断增加。Al3+浓度在29.90～253.41 μmol/L范围内，以Al3+浓度为横坐标，NCFP的荧光强度为纵坐标，作图发现NCFP荧光强度与Al3+浓度呈现出良好的线性关系(图4(b))；相关系数R2=0.997 9；用 3 倍于 10 次测定空白溶液的标准偏差来计算，检出限达到4.279 μmol/L。

图4 (a) Al3+浓度对NCFP荧光强度的影响；(b) 探针荧光强度随 Al3+浓度(29.90～253.41 μmol/L)变化的线性关系图。

Fig.4 (a) Effects of Al3+concentration on the fluorescent intensity of NCFP. (b) Fluorescent intensity of the probe as a function of concentration of Al3+(29.90-253.41 μmol/L).

3.5 NCFP与Al3+的结合模式及响应机理推测

根据Job法，将NCFP和Al3+总浓度保持为10 μmol/L，改变 Al3+的摩尔分数从0.1～1.0，测其荧光强度，绘制(I-I0)/I0-x曲线。

由图5明显看出,改变 Al3+的摩尔分数，探针在最大发射波长处的荧光强度随之变化。当Al3+的摩尔分数为 0.5时,NCFP和 Al3+络合物在392 nm处出现最大的荧光发射,表明NCFP与 Al3+以 1∶1络合。

图5 NCFP与Al3+的络合曲线，I0为空白探针的荧光强度，I为不同Al3 +摩尔分数下探针的荧光强度。

Fig.5 Job’s plot of NCFP and Al3 +.I0is the fluorescent intensity of the blank probe,Iis fluorescent intensity of the probe under different Al3+mole fraction.

基于光致电子转移(PET)原理[16]，当探针中1，8-萘酰亚胺荧光团电子受到激发光的辐射后，由基态跃迁至激发态，邻近的富电子体吗啉胍上氨基将孤对电子通过分子内电子转移方式，传递给激发态的荧光团，使原激发态分子能量降低，整体表现为荧光强度降低或猝灭。当探针分子遇到Al3+时，吗啉胍将孤对电子进入Al3+的空p轨道进行配位，形成单中心三配位六元环的配合物，孤对电子不再转移至激发态荧光团，使荧光团激发态电子可以通过辐射跃迁回到基态，荧光恢复(图6)，实现对金属离子的选择性结合。

图6 荧光探针对Al3+的响应机理

4 结论

通过亚酰胺化、缩合等反应，合成了一种萘酰亚胺接枝壳聚糖的增强型荧光探针，在392 nm处，可以高选择性识别Al3+，且探针与Al3+以1∶1方式结合，常见的共存金属离子没有干扰。在29.90～253.41 μmol/L Al3+浓度范围内，探针的荧光强度与 Al3+浓度有良好的线性关系，相关系数R2=0.997 9，Al3+的最低检出限达4.279 μmol/L，探针 NCFP 表现出较明显的光谱响应。接枝上生物相容性好的壳聚糖的荧光探针，有望用于环境中Al3+的检测。

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