响应面法优化索式提取茄子根中总黄酮工艺的研究

王亚红,贾颖超

(吉林化工学院 化学与制药工程学院,吉林 吉林 132022)

茄子性味古寒，有散血瘀、消肿止疼、治疗寒热、祛风通络和止血等功效.茄子根含有极为丰富的生物活性成分-黄酮类化合物[1].黄酮类化合物又称生物类黄酮，是植物经光合作用产生的一大类化合物[2].黄酮类化合物具有一定的药学性能，如增强机体免疫力、降血糖、降低心肌耗氧量、增加冠状动脉及脑血管流量、消除体内自由基、抗氧化、抗衰老等功能[3].此外，天然黄酮类化合物因具有相对安全的特点在食品加工中广泛用作添加剂[4].在大多数地区，茄子根随意丢弃或焚烧，不但没有将资源合理利用，还污染环境.因此，茄子根中总黄酮的提取对生产生活有很重要的现实意义[5].

索氏提取法采用溶剂回流和虹吸原理，连续提取固体物料，既节省溶剂又可以提高提取效率[6].本研究用索氏提取器提取茄子根中总黄酮，为其进一步分离提纯和生产实践应用奠定基础.

1　实验部分

1.1　实验材料

茄子根饮片购于吉林市江城大药房；试剂主要有无水乙醇(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；无水三氯化铝(分析纯)，天津市永大化学试剂开发中心；醋酸钠(分析纯)，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；醋酸(分析纯)，天津市福晨化学试剂厂.

1.2　实验仪器

FA2204N型电子分析天平，上海箐海仪器有限公司；DNG-9076A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；759型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司.

1.3　实验方法

1.3.1对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的对照品芦丁7.2 mg，用无水乙醇溶解定容至25 mL容量瓶中，取上述溶液10 mL定容于25 mL容量瓶中，配制成浓度为0.115 2 mg/mL对照品溶液.

1.3.2供试品溶液的制备

准确称取干燥的茄子根粉末2 g，以60%乙醇为溶媒，液料比为35 mL/g，用索氏提取器提取两次，提取时间为3 h，减压过滤后，合并两次提取液，密封备用.

1.3.3检测波长的确定

分别移取芦丁对照品溶液、供试品溶液各2 mL置10 mL容量瓶中，各加入质量浓度为1.34%的三氯化铝溶液2 mL，pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液1 mL，充分振摇混合，用60%乙醇定容.40 ℃水浴加热15 min，以不加对照品溶液的空白组为对照，在同一台紫外分光光度仪进行最大吸收波长的扫描.

1.3.4标准曲线的绘制

精密移取芦丁对照品溶液1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL分别置于5个10 mL容量瓶中，各加入质量浓度为1.34%的三氯化铝溶液2 mL，pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液1 mL，充分振摇混合，用60%乙醇定容.40 ℃水浴加热15 min，以不加对照品溶液的空白组为对照，于398 nm处测定吸光度[7,8].

1.3.5茄子根总黄酮提取率计算

移取每次实验合并所得的提取液适量置于10 mL容量瓶中，按照1.3.4方法测定吸光度，若结果超出线性范围则做稀释或浓缩处理.依据标准曲线计算提取率，公式如下[9]：

其中w%为茄子根总黄酮提取率，y为吸光度，n为稀释倍数，V1为每次实验合并所得提取液体积，单位为mL.

1.3.6茄子根前处理与提取率关系

分别准确称取干燥的24目、50目、65目、80目、100目茄子根粉末2 g，按照1.3.2项方法提取，按照1.3.4项方法测定吸光度，依据标准曲线计算提取率.

1.3.7单因素实验

准确称取干燥的50目茄子根粉末2 g，分别就乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)，提取时间(2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h)，溶媒用量(15 mL/g、25 mL/g、35 mL/g、45 mL/g、55 mL/g)，按照1.3.2项实验方法进行单因素实验.

1.3.8响应面实验

依据单因素实验结果，根据Box-Behnken实验设计原理，运用Design Expert 8.0.6软件设计响应面实验，分别以乙醇浓度、提取时间、溶媒用量这三个因素设计三水平共计17次实验，以总黄酮的提取率为响应指标确定最佳工艺条件，因素水平如表1[10].

表1　因素水平表

2　结果与分析

2.1　检测波长的确定

扫描结果显示，对照品溶液、供试品溶液的最大吸收峰均出现在398 nm，所以本实验确定398 nm为测定波长.

2.2　标准曲线的绘制

以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=22.156X-0.044 4.R2=0.999 5.结果表明芦丁在0.014～0.032 mg/mL范围内呈良好的线性关系.

2.3　茄子根前处理与提取率关系

茄子根粉末目数对总黄酮提取率的影响见图1.

茄子根粉末目数图1　茄子根粉末目数对总黄酮提取率的影响

由图1可知，茄子根总黄酮的提取率随着药粉目数的增大先增大后减小，当目数达到50目时，茄子根的提取率达到最大值.确定以50目茄子根粉末为原料完成所有实验研究.

2.4　单因素实验

2.4.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

乙醇浓度的影响如图2所示.

乙醇浓度/%图2　乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

从图2可以看出，茄子根总黄酮的提取率先随着乙醇浓度增加而有所提高，当乙醇浓度为40%时处于一个最高点，随后提取率随乙醇浓度增加而下降.确定40%乙醇浓度进行响应面实验设计.

2.4.2提取时间对总黄酮提取率的影响

提取时间的影响见图3.

提取时间/h图3　提取时间对总黄酮提取率的影响

从图3可知，茄子根总黄酮的提取率随着提取时间的增加而呈现先增后减的变化趋势，当提取时间达到3.5 h的时候，总黄酮提取率达到最大值.确定3.5 h进行响应面实验设计.

2.4.3溶媒用量对总黄酮提取率的影响

溶媒用量的影响见图4.

溶媒用量/(mL/g)图4　溶媒用量对总黄酮提取率的影响

从图4可知，茄子根总黄酮的提取率随着溶媒用量的增加而增加，当溶媒用量为25 mL/g时，总黄酮提取率最大，随后提取率开始下降.确定25 mL/g进行响应面实验设计.

2.5　响应面实验

2.5.1响应面实验结果

响应面实验结果如表2所示.

表2　响应面实验结果

采用Design Expert 8.0.6软件对表中实验结果进行多项拟合回归，得到总黄酮提取率对乙醇浓度、提取时间、溶媒用量的二次多项回归模型，回归方程为：

Y=0.42+0.016A+0.018B+2.000E-003C-0.012AB+7.500E-004AC+0.02BC-0.035A2-0.039B2-0.053C2.

其中Y为茄子根总黄酮提取率预测值，A、B、C分别为上述3个自变量的编码值.

2.5.2方差分析与显著性检验

方差分析与显著性检验见表3.

由表3可以看出模型显著(p<0.005)，在统计学上是有实际意义的，失拟项是不显著的(p>0.05)，所以该实验模型与实验的拟合度良好且实验数据合理可靠.模型的R2=0.922 2，说明响应值的变化有92.22%来源于所选自变量，因变量和所选自变量之间的线性关系显著，进一步说明该回归方程可以替代实验真实点对实验结果进行分析.模拟的二次项A2、B2、C2均达到显著水平，响应面模型一次项溶媒用量B达到显著水平，表明溶媒用量对茄子根总黄酮提取的影响不是简单的线性关系.本模型可以得到足够的响应信号，因此可以用此模型分析和预测茄子根总黄酮提取工艺结果.

表3　回归模型方差分析

注：P<0.000 1为极显著，P<0.01为非常显著，P<0.05为显著.

2.5.3响应面分析

采用Design Expert 8.0.6软件，将三种因素两两进行分析比较，根据回归方程，各因素间交互作用的响应面见图5～图7.

乙醇浓度/%

图5　乙醇浓度与溶媒用量交互作用对提取率的影响

响应曲面反映每两个影响因素之间的交互作用，考察响应面可进一步确定溶媒用量对总黄酮提取率的影响最大，乙醇浓度次之，提取时间对其影响相对较小.等高线的形状反映交互作用的强弱大小，圆形表示两因素的交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著.

图5中显示乙醇浓度与溶媒用量交互作用对提取率有影响，但不显著.随着乙醇浓度的增高，总黄酮提取率呈现先增高后降低趋势；随着溶媒用量增多，总黄酮提取率呈现先增加后降低趋势.乙醇浓度在40%～45%之间，溶媒用量在20～30 mL/g之间，茄子根总黄酮提取率达到本次实验最大值.

图6中显示了乙醇浓度与时间交互作用对提取率有影响，但不显著.随着乙醇浓度的增高，黄酮提取率呈现先增高后降低趋势；随着时间的增大，总黄酮提取率呈现先增加后降低趋势.乙醇浓度在40%～45%之间，时间在3.6～3.8 h之间，茄子根总黄酮提取率达到本次实验最大值.

时间/h

图6　乙醇浓度与时间交互作用对提取率的影响

图7中显示了溶媒用量与时间交互作用对提取率有影响，但不显著.随着溶媒用量增多，总黄酮提取率呈现先增高后降低趋势；随着时间的增大，总黄酮提取率呈现先增加后降低趋势.溶媒用量在20～30 mL/g之间，时间在3.6～3.8 h之间，茄子根总黄酮提取率达到本次实验最大值.

时间/h

图7　溶媒用量与时间交互作用对提取率的影响

2.5.4响应面最佳条件确定

经过Design Expert分析，得到模型最佳数据为乙醇浓度42.20%、溶媒用量25.62 mL/g、提取时间3.60 h，模型预测总黄酮提取率为0.424%.为了具有可操作性，将上述数据修正为乙醇浓度42%，溶媒用量26 mL/g，提取时间3.6 h.

2.5.5模型的验证

为检验响应面优化结果的科学性，按照修正后的最佳条件提取茄子根总黄酮，3次平行实验提取率分别为0.423%、0.427%、0.425%，平均值为0.425%，RSD值为0.007%.

实验值与预测值相对误差为0.24%.因此采用响应面法优化得到的索氏提取茄子根总黄酮的条件参数准确可靠.

3　结　　论

本研究通过茄子根前处理与提取率关系实验确定茄子根粉末最适宜粒度为50目基础之上，采用单因素实验考察了乙醇浓度、提取时间、溶媒用量对总黄酮提取率的影响，将乙醇浓度考察范围定为30～50%，提取时间考察范围定为3～4 h、溶媒用量考察范围定为15～35 mL/g.通过星点设计-响应面法，建立了茄子根总黄酮索氏提取的数学模型，模型的决定系数为0.922 2，方程显著，拟合良好，可以进行实际预测，并最终确定茄子根总黄酮索氏提取最佳工艺条件为：乙醇浓度42%，溶媒用量26 mL/g，提取时间3.6 h，茄子根粉末目数50目.3次验证实验平均提取率为0.425%，和模型预测的提取率0.424%相对误差0.24%，因此响应面法对茄子根总黄酮提取的优化是可行的，优化得到的总黄酮提取工艺条件具有实际应用价值.

参考文献：

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