病理性瘢痕组织中Bcl-2、Fas蛋白的表达及意义

赵 滨 ， 阴亚坤 ， 李 轲

（1.河南省直第三人民医院皮肤科，河南 郑州，450000；2.郑州大学第一附属医院皮肤科，河南 郑州，450000）

瘢痕是促进伤口愈合的生理进程产物，瘢痕纤维组织修复过程中由于创面的不完全张力，可导致瘢痕组织断裂-再修复的循环过程，形成病理性瘢痕组织[1]。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，相关研究指出其组织学特点包括成纤维细胞的过度增殖、凋亡受抑制、大量的细胞外基质和胶原纤维排列紊乱等[2]。病理性瘢痕可致使患者皮肤外表美观度受损，伴有灼痛瘙痒等，并由于挛缩畸形造成功能障碍[3]，深入研究其形成机制对治疗病理性瘢痕具有较多积极意义。基于此，本研究回顾性分析我院行瘢痕切除术患者96例临床资料，以探究病理性瘢痕组织中B细胞白血病2蛋白（Bcl-2）、自杀相关因子（Fas蛋白）的表达及意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年6月～2017年6月间行瘢痕切除术患者96例临床资料。纳入标准：符合瘢痕切除术指征且于我院行手术者；年龄＞18岁者。排除标准：合并其他皮肤疾病者；精神心理疾病史者；经放射或免疫治疗者；病理监测结果等临床资料不完整者。根据切除组织病理检查结果分为病理性瘢痕组（n=46）和非病理性瘢痕组（n=50）。对照组为非病理性瘢痕组患者正常皮肤组织。病理性瘢痕组：男女分别为28例、18例，年龄22～43岁、平均年龄（26.439.83）岁。非病理性瘢痕组：男女分别为27例、23例，年龄20～39岁、平均年龄（25.799.43）岁。2组一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方 法

所有标本均经10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，行连续切片，一张切片做苏木精-伊红（HE）染色，其余做免疫组化染色；均严格按照试剂盒说明进行染色。常规脱蜡后蒸馏水洗5min，置于蒸馏水新鲜配置的3%过氧化氢室温孵育15min，消除内源性过氧化物酶活性，经蒸馏水洗3次、每次2min，磷酸缓冲盐溶液浸泡2次、每次5min；将切片进入枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0），再放入沸腾高压锅8min，冷水冲至室温后孵育30min，蒸馏水洗5min、磷酸缓冲盐溶液洗2次、每次3min；滴加二抗同种动物血清封闭液，室温孵育10min，滴加一抗工作液，4℃下过夜，0.01ml磷酸缓冲盐溶液洗3次、每次5min；滴加即用型生物素标记二抗，置37℃中孵育30min，0.01ml磷酸缓冲盐溶液洗3次、每次5min；滴加辣根酶标记链霉卵蛋白工作液，37℃孵育30min，0.01ml磷酸缓冲盐溶液洗3次、每次5min；滴加DAB显色剂，显微镜下控制显色时间、观察显色反应，显色适度时以蒸馏水终止反应，苏木素复染30s，蒸馏水水洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗；梯度酒精脱水后，中性树胶封片。

1.3 评估标准

镜下观察切片着色强度及面积进行评分，着色强度0～3分，（0分：无着色、1分：淡黄色、2分：棕黄色、3分：棕褐色），阳性着色面积0～3分（0分：无着色、1分：着色面积＜1/3、2分：着色面积1/3～2/3、3分：着色面积＜2/3），2项之和≥3分为阳性[4]；400倍光镜下观察免疫组化结果，每例切片随机选5个视野，每视野观察100个细胞，记录阳性细胞数并测算5个视野的细胞平均阳性率。

1.4 观察指标

比较3组Bcl-2、Fas蛋白阳性率及平均阳性细胞率，利用pearson相关分析Bcl-2、Fas蛋白的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量数据以（x±s）表示，行t检验或单因素方差分析，计数数据以[n(%)]表示，行χ2检验或Fisher精确概率检验，线性相关关系分析使用pearson相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组阳性率对比

Bcl-2阳性率病理性瘢痕组高于非病理性瘢痕组和对照组（P＜0.05）、非病理性瘢痕组高于对照组（P＜0.05），Fas阳性率病理性瘢痕组低于非病理性瘢痕组和对照组（P＜0.05）、非病理性瘢痕组低于对照组（P＜0.05），如表1所示。

2.2 3组平均阳性细胞率对比

Bcl-2平均阳性细胞率高于非病理性瘢痕组和对照组（t=9.982、19.393），非病理性瘢痕组高于对照组（t=12.729），Fas平均阳性细胞率低于非病理性瘢痕组和对照组（t=7.350、24.942）、非病理性瘢痕组低于对照组（t=14.306），如表2制，所示。

2.3 Bcl-2、as蛋白的相关性

pearson相关分析结果显示，Bcl-2和Fas呈负相关关系（r=-0.684，P=0.000）。

3 讨 论

病理性瘢痕的病理基础是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增生和以胶原为主的细胞外基质成分的过度沉积，而成纤维细胞调控增生性瘢痕的形成依赖分泌的多种细胞活性成分[5]。减轻患者的不适感并满足病理性瘢痕患者的审美需求是合理的，激光治疗是目前使用较多的治疗手段之一[6]，但治疗花费较多、还具有一定风险。目前治疗病理性瘢痕的药物研究主要针对其功能异常的成纤维细胞，通过直接或间接抑制成纤维细胞的增殖、侵袭和胶原合成来阻止疾病进展[7]，因此研究调控成纤维细胞的相关因子具有较多积极意义。

表1 3组阳性率对比[n（%）]

表2 3组平均阳性细胞率对比（xs±，%）

细胞凋亡收到细胞内凋亡调节蛋白的调控，而凋亡蛋白分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两类，Bcl-2家族在细胞凋亡中起关键作用[8]。相关研究发现，Bcl家族在肥厚性瘢痕生成中也起重要作用[9]。本研究结果显示，病理性瘢痕组标本中Bcl-2阳性率和平均阳性细胞率显著高于非病理性瘢痕组和对照组，且非病理性瘢痕组高于对照组，这表明Bcl-2表达上升可在病理性和非病理性瘢痕形成中起作用。Bcl-2细胞表达上升，与Bax蛋白形成二聚体，阻断细胞色素C释放，则成纤维细胞凋亡受到抑制[10]，使瘢痕中成纤维细胞过度增殖、胶原蛋白过度累积，促进病理性瘢痕发生。周曙[11]等学者在其论著中表示，姜黄素可通过调节Bcl-2/Bax蛋白的表达比例来诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，与本文结论相互印证。国外也有学者使用肿瘤坏死因子α刺激基因-6处理病理性瘢痕后发现，Bcl-2表达水平下降，Bax蛋白上升[12]。

Fas/Fas受体系统介导的信号通路是细胞凋亡的重要途径之一[13]。Fas受体在正常皮肤及病理性瘢痕成纤维细胞膜上均有分布，本研究结果显示，Fas蛋白在病理性和非病理瘢痕中阳性率和平均阳性细胞率均低于正常皮肤，即Fas在瘢痕形成中低表达。同时，Bcl-2和Fas蛋白呈负相关关系，说明凋亡途径和抗凋亡途径两者在病理性瘢痕形成机制中均有影响，且两因子相互关联，但其具体机制仍需进一步研究。病理性瘢痕相关研究从细胞因子、蛋白组学等领域进行探讨[14]，以期从不同层面中分析病理性瘢痕形成机制，为指导临床治疗和药物研究提供新思路。病理性瘢痕中主要是成纤维细胞和血管内皮细胞，李云飞[15]等学者发现，病理性瘢痕中血管内皮生长因子等促血管生成细胞生长因子也呈高表达，说明血管内皮细胞增殖也参与病理性瘢痕形成。

本研究虽获得一定结论，但受观察时间和样本量影响仍存在一定局限性。病理性瘢痕组织形成明显受Bcl-2及Fas蛋白影响，同时也受促血管生长细胞生长因子的影响，因此相关研究者可进一步探究影响病理性瘢痕不同因子间的相关关系，以期进一步找到消除病理性瘢痕的关键因素。调节Bcl-2及Fas蛋白表达水平是消除病理性瘢痕的有效机同时Bcl-2在肿瘤细胞生长和转移中也起一定作用[16]，相关药物研究也可以从此入手，以推动临床新药研究。

综上所述，病理性瘢痕中Bcl-2表达水平高于非病理性瘢痕和正常皮肤，Fas蛋白则在病理性瘢痕中低表达。

[1]贾小丽,高锋.转化生长因子-β1蛋白及其mRNA在病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表达及意义[J].山西医药杂志,2015,44(05):532-535.

[2]杜逸凤,潘宁,吴冬梅.病理性瘢痕与多种细胞因子相关性的研究进展[J].实用医院临床杂志,2016,13(1):141-144.

[3]张苏文,李小静,陈钊,等.TSG-6对人病理性瘢痕成纤维细胞增殖与凋亡的影响[J].安徽医科大学学报,2016,51(1):102-105.

[4]刘启胜.病理性瘢痕成纤维细胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表达及意义[J].中国美容医学杂志,2017,26(11):63-65.

[5]李梦芸,刘德伍.病理性瘢痕的研究和治疗现状[J].实用皮肤病学杂志,2017,10(3):161-165.

[6]Poetschke J,Gauglitz G G.Current options for the treatment of pathological scarring.[J].Journal Der Deutschen Dermatologischen Gesellscha ft,2016,14(5):467-477.

[7]陈斌,康春福,于东宁,等.辛伐他汀对不同病理条件刺激的瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响[J].中华整形外科杂志,2016,32(2):130-135.

[8]田黎明,谢红付,李吉,等.β联蛋白对过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞增殖活性及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响[J].中华皮肤科杂志,2015,48(2):112-115.

[9]Shi J,Shi S,Wu B,etal.Autophagy protein LC3 regulates the fibrosis of hypertrophic scar by controlling Bcl-xL in dermal fibroblasts.[J].Oncotarg et,2017,8(55):93757-93770.

[10]庞若宇,关美萍,郑宗基,等.二甲双胍对糖基化终末产物诱导的成纤维细胞凋亡及相关蛋白caspase-3、Bax及Bcl-2表达的影响[J].南方医科大学学报,2015,35(06):898-902.

[11]周曙,田芳,金海蓉,等.姜黄素调节Bcl-2、Bax蛋白表达诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡[J].湖南中医药大学学报,2015,35(4):6-9.

[12]Wang H,Chen Z,Li X,etal.TSG-6 treatment promoted apoptosis in human fibroblasts of pathological scar.[J].Cellular and molecular biology(Noisy-le-Grand,France),2016,62(6):33.

[13周]荣秒,牛朝旭,李宾,等.沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞凋亡和侵袭的影响及其作用机制[J].肿瘤,2016,34(12):1102-1108.

[14]彭颖,陈斌,汪虹,等.蛋白质组学在病理性瘢痕中的研究进展[J].实用医学杂志,2017,33(13):2236-2238.

[15]李云飞,龙晓东,李永忠.病理性瘢痕组织中VEGF、CD_(105)表达变化及意义[J].山东医药,2015,55(22):67-68.

[16]Duan Y,He Q,Yue K,etal.Hypoxia induced Bcl-2/Twist1 complex promotes tumor cell invasion in oral squamous cell carcinoma[J].Oncotarget,2016,8(5):7729-7739.