电针对木瓜蛋白酶致骨关节炎犬血浆中腺苷的影响

朱兆荣 ， 关 璐 ， 彭 诗 ， 刘 娟

(1.西南大学动物科技学院 ， 重庆 荣昌 402460 ； 2.重庆市兽医科学工程研究中心中药创新研究室 ， 重庆 荣昌 402460)

骨关节炎是犬的一种退行性骨关节疾病，是由于增龄、创伤、关节先天性异常、关节畸形等原因引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，是犬的一种比较常见多发的疾病，患病时伴有炎症反应和疼痛反应。膝关节周围有很多穴位，通过电针对它们的刺激能有效促进机体对内源性镇痛物质的释放，起到明显缓解疼痛，消除炎症的作用，同时可以促进血液循环，疏通经脉，利于关节软骨再生修复和周围组织渗透液的吸收。腺苷作为一种重要的抑制炎症反应的内源性核苷[1]，其受体还与疼痛信息传递和调控有关[2]。腺苷常用测定方法有纸层析分光光度法[3]、紫外分光光度法[4]、高效液相测定等，其中高效液相色谱法具有高效高速高灵敏度的特点，可以更好的分离血浆中相对含量较少的腺苷，因此选用高效液相法以及最适条件进行含量测定。本研究采用木瓜蛋白酶制造犬骨关节炎模型，采用电针方法治疗至痊愈，通过高效液相法测定腺苷含量变化，为电针治疗骨关节炎的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 中华田园犬32只，平均年龄3个月龄，体重2.5±0.5 kg，由西南大学荣昌校区实验动物科提供。

1.2 试剂及仪器 木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)；低速离心机(菲恰尔GL-16A)；Model 680酶标仪(Bio-Rad Laboratories，Inc)；华佗牌电子针疗仪(SDZ-Ⅱ，苏州医疗用品厂有限公司)；LC-20AD型泵(日本岛津公司)；SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司)；CTO-20A柱温箱(日本岛津公司)；DGU-20A3脱气机(日本岛津公司)；C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)(日本岛津公司)；AE-240S电子分析天平(梅特勒—托利多仪器有限公司)；AB135-S型十万分之一电子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；SB-25-12型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.3 动物模型建立与分组处理 参照文献[5]，选取32只健康中华田园犬随机分对照组和模型组，模型组于试验开始第1、4、7天，在左膝关节腔注射0.5 mL体积分数4%木瓜蛋白酶，对照组同时注射生理盐水0.5 mL，将模型建立成功的犬随机分为3组，每组8只，即：模型组(不治疗)、电针1组(电针[4]左侧环跳穴、阳陵泉穴、后三里穴)、电针2组(电针[6]左侧环跳穴、掠草穴、肾俞穴)，以30号针针刺20 min，1次/d，连续14 d，采血检测犬血浆中腺苷含量。

1.4 犬血浆中腺苷的高效液相色谱溶液制备

1.4.1 对照品溶液制备 取腺苷标准品适量，精密称定10 mg，加纯化水制成1 g/L腺苷储备液。分别精密量取储备液适量，并用纯化水定容于10 mL量瓶中，摇匀，配置成系列标准溶液。

1.4.2 供试品溶液制备 取新鲜犬血，静置使腺苷被细胞完全灭活。将75 mmol/L-1的双嘧达莫氯仿溶液1 mL加入洁净离心管中，轻轻振摇，使整个管壁接触到溶液，然后静置待液体蒸发干，备用。将采集静置后的血样置于上述双嘧达莫离心管中，立即以3 500 r/min离心5 min分离出血浆。

1.5 犬血浆中腺苷的高效液相色谱测定方法学考察

1.5.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液[50 mmol/L-1磷酸二氢钠-50 mmol/L-1磷酸氢二钠，500∶80]-甲醇(80∶20，pH值5.9)为流动相；柱温：35 ℃；检测波长为254 nm，进样20 μL；流速：1 mL/min。

1.5.2 方法专属性考察 取新鲜犬血，静置使腺苷被细胞完全灭活，3 500 r/min离心5 min，分离得空白血浆。分别取腺苷标准品、血浆样品、空白血浆以及空白血浆加腺苷标准品适量，按“1.4.1”项下操作，将配置好的待测样品按上述色谱条件分别进行测定。

1.5.3 线性关系考察 取腺苷对照品储备液1 g/L，用纯化水依次稀释为40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。按上述色谱条件进行测定，测定结果以对照品浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，用最小二乘法进行线性回归分析。

1.5.4 稳定性试验 样品采集按照1.4.2项下的要求，在室温下立即放置2 h后进行预处理。预处理后立即放置20 min和40 min后分别进样测定含量。

1.5.5 精密性试验 精密量取空白血浆样品200 μL，加入适量腺苷标准溶液，制成浓度为40 mg/L 血浆样品溶液，按照上述色谱条件进样测定，平行测定6次，计算腺苷峰面积分值RSD。

1.5.6 重复性试验 取同批血浆样品6份，按供试品溶液配制方法制备，分别进行测定，记录色谱图，计算腺苷含量和RSD值。

1.5.7 加样回收试验 精密量取空白血浆样品200 μL，加入适量腺苷标准溶液，制成浓度为40 mg/L血浆样品溶液，按照上述色谱条件进样测定，并带入标准曲线计算浓度和回收率，测定本试验建立的方法的准确性，通过平行设定6个重复。

1.6 高效液相色谱测定犬血浆中腺苷含量

1.6.1 标准品及样品制备 同“1.4.1”及“1.4.2”。

1.6.2 样品测定 精密量取血浆样品200 μL，加入100 μL纯化水，再加入400 μL乙腈，静置10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液测定，进样量20 μL,检测，外标法计算含量。

1.7 统计分析方法 统计分析用SPSS19.0统计软件，对所有数据进行显著性检验，并进行分析比较，试验数据用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 高效液相色谱测定犬血浆中腺苷的方法学考察结果 为考察高效液相色谱测定犬血浆中腺苷的方法是否可行，本试验进行了如下专属性、稳定性和精密性考察。

2.1.1 专属性考察 测定结果色谱图见图1，在腺苷对照品峰(图1A)的保留时间上供试品(图1B)有相应的色谱峰出现，阴性对照无对应色谱峰(图1C)，表明用此法在测定犬血浆中腺苷含量时具有较好的专属性。

2.1.2 线性关系考察 用建立的犬血浆中腺苷含量测定方法测定在浓度为40 μg/mL～0.5 μg/mL腺苷对照品溶液，进样量20 μL，计算得到线性回归方程为Y=1×10-5X-0.0183，回归系数R=0.9999，表明腺苷在0.50～40.00 mg/L内线性关系良好。

图1 腺苷色谱

2.1.3 稳定性试验 计算得腺苷含量RSD分别为0.2961%和3.9864%，结果说明制备的供试品溶液在2 h内稳定。

2.1.4 精密性试验 计算得腺苷峰面积分值RSD为0.090%。说明建立方法的精密度良好。

2.2 重复性试验 计算腺苷含量和RSD值，平均含量为0.0054%，相对标准偏差RSD=6.294%。结果说明该方法重复性良好。

2.3 加样回收试验 测得平均回收率(n=6)为99.96%，相对标准偏差RSD=0.045%。

2.4 高效液相色谱测定犬血浆中腺苷含量结果 结果表明，模型组血浆中腺苷含量明显下降，和对照组比较，差异极显著(P<0.01)；电针1组、电针2组血浆中腺苷含量明显升高，与模型组比较，差异极显著(P<0.01)，电针1组与电针2组之间比较差异极显著(P<0.01)；结果见表1。

表1 电针治疗后各组犬血浆中腺苷水平

注：同列肩标不同字母表示差异极显著(P<0.01)

3 分析讨论

中医认为骨关节炎属于“痹症”，多由风、寒、湿、热、痰、瘀引起，兼肝、肾虚致正气不足、筋骨不固，风寒湿邪阻滞经络，导致气血运行不畅，经络阻滞，久之骨失所养而发病。治疗以温经通络、活血逐痹为主。本试验中，选取环跳、掠草为主穴，分别选取阳陵泉、后三里和肾腧、后跟为配穴。通过针刺肢体穴位，以达到益气活血、通络止痛的作用。环跳穴为足少阳胆经与足太阳膀胱经交会穴,膀胱与肾相表里,故其具有益肾气固胞宫之功,肝与胆相表里,肝喜条达,胆欲疏通,太阳主表,少阳主枢,故其具有疏通经络,宣表散寒,调理气血,祛风胜湿,通阳助阳之效[6]。有研究表明[7]，环跳穴在改善膝骨关节炎患者临床症状体征积分方面优于常规针刺。掠草主治膝关节扭伤、神经痛等；阳陵泉主治后肢麻痹、膝关节扭伤；后三里主治后肢疼痛，有学者研究[8]表明，后三里具有确切的镇痛作用；肾俞主治扭伤，后跟主治扭伤、后肢麻痹。前期临床试验结果显示，本试验中选用的电针疗法[10]，改善了膝关节血液循环，有利于吸收多余关节渗出液以及促进修复骨关节滑膜，使犬的膝关节功能恢复正常，疼痛肿胀消失，运动恢复正常。

膝关节腔内注射木瓜蛋白酶溶液可导致白细胞数量增多[9]，因此犬骨关节炎会伴随炎症反应。炎症，是机体抵御外来刺激的一种防御性免疫机制，过度的炎症反应则会对机体造成损伤，嗜中性粒细胞是其中重要的参与者之一，有研究表明[10]，腺苷及其受体可以通过参与其粘附、迁移、细菌杀伤作用、炎症介质产生、凋亡等过程的调节，从而对炎症起到调节作用。腺苷存在于外周血液及中枢神经系统中，是一种具有多种调节作用的神经活性物质，主要通过与细胞表面的特殊受体结合后发挥作用。犬患骨关节炎后，局部炎症反应强烈，腺苷含量明显降低，导致机体调节炎症的能力下降，电针刺激后，腺苷含量有所上升，可能是高浓度的腺苷降低了嗜中性粒细胞与血管内皮的粘附作用[11]，从而减轻了炎症。

当炎症反应加强时，会引起痛觉敏感性升高，机体产生疼痛反应。研究表明，内源性核苷及其类似物在疼痛调节方面有一定作用[12]。腺苷受体中的A1受体主要分布在脊髓中，内源性腺苷通过激活A1受体抑制病理性痛。本试验模型组犬血清腺

苷含量明显降低，在电针刺激后局部血液组织中的腺苷含量明显升高，说明其可能与脊髓中A1受体相结合，从而减轻疼痛反应。推测犬血清腺苷含量升高和降低与犬疼痛症状出现和减轻相关。

综上所述，电针环跳等穴可升高骨关节炎犬血清腺苷水平，降低炎症反应，减缓疼痛，同时电针掠草等穴也能产生同样治疗效果，这可能与电针改善局部血液循环、缓解炎症状态及局部张力、提高痛阈有关，推测电针刺激可通过调节腺苷分泌的增多和减少，使膝关节的功能得以恢复。

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