黑叶猴支原体及细菌混合感染的诊治

胡玲玲 ， 汤德元 ， 曾智勇，王 彬 ， 黄 涛 ， 龙冬梅 ， 石远菊 ， 叶 丽 ， 杨 伟 ， 李 波

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州 贵阳 550025 ； 2.遵义市红花岗区农牧局 ， 贵州 遵义 563000)

2016年夏，贵州省某动物园国家一级保护动物黑叶猴4只均出现流涎、喘气、消瘦、被毛脱落、全身无力等症状，其中2只发病1 d后死亡。该黑叶猴没有接种过任何疫苗。为弄清病因，于是送检发病死亡黑叶猴1只及发病猴血液2份到我校物动物医院进行确诊。根据临床症状、病理剖检和实验室诊断，确诊黑叶猴为支原体感染、链球菌及结核分支杆菌混合感染引起死亡。现报道如下。

1 临床症状

黑叶猴发病前身体消瘦，被毛脱落、粗乱，发病后心跳为100次/min、呼吸次数为79次/min，伴有喘气、食欲下降、口鼻有半透明黏稠液体流出，同时出现轻度拉稀现象，随着病情的发展发病黑叶猴出现全身无力、反应迟钝、行走不稳、心力衰竭和呼吸衰竭死亡。

2 剖检变化

剖检可见病死黑叶猴(10岁左右)腹腔有积液，胃肠充气、有较厚的肠系膜脂肪覆盖、胃肠黏膜未见明显充血和出血；气管及鼻腔中有大量黏稠液体；肺脏出现不同程度坏死灶及淤血斑(见中插彩版图1)；肝脏表面有严重瘀斑(见中插彩版图2)、变脆，边缘部分出现坏死灶； 肾脏有大面积出血点(见中插彩版图3)；脾脏色泽变深、变硬；心脏包囊有积液，也有少许瘀斑。

3 实验室诊断

3.1 细菌分离培养 取死亡黑叶猴的内脏及无菌采集的血液进行细菌分离培养，接种于血琼脂培养基中，37 ℃ 恒温箱中厌氧/需氧培养 24 h～48 h观察细菌的生长状态和菌落特征，然后挑取单个菌落进行纯培养。结果在需氧和厌氧环境下，血琼脂培养基中均有菌落生成，判定分离菌为兼性厌氧菌，培养24 h后能观察到灰白色、露滴状、表面光滑，边缘整齐的菌落，菌落周围有明显的溶血环。革兰染色镜检可见，蓝紫色圆形、链状革兰阳性球菌(如图4)。

3.2 细菌的生化特性鉴定 分离菌经 24 h 纯培养后，得到的纯培养物接种于微量生化鉴定管中，37 ℃，5%CO2恒温培养箱培养24～48 h，结果该分离菌株能发酵葡萄糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、淀粉，不能利用6.5%氯化钠、甘露醇、肌醇、0.1%美蓝牛乳，不液化明胶，与标准菌株相比具有典型的链球菌的生化特性，根据经生化试验结果，再结合细菌培养特性，判断该分离菌为链球菌。

图4 10x100油镜下的革兰阳性链状球菌

3.3 药敏试验 挑取单菌落于1 mL液体培养基中，37 ℃恒温震荡培养1 h后均匀涂板于血琼脂平板，而后间隔适当距离放置药敏纸片。药敏试验结果显示，对庆大霉素、林可霉素、阿莫西林、头孢曲松、氨苄西林抑菌圈直径<10.00 mm属低敏；卡那霉素和青霉素抑菌圈均>13.00 mm属中度敏感；而氧氟沙星抑菌圈为17.50 mm属高敏。

3.4 支原体PCR检测 剖检采集黑叶猴的肺脏及口腔黏液，适量取样研磨后反复冻融3次，匀浆器磨20 min后收集匀浆，12 000 r/min 离心10 min，取上清提取DNA(按支原体PCR检测核酸提取试剂盒使用说明书)。用支原体PCR 检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)进行 PCR 检测。反应体系为(总体积20 μL) ：16 μL PCR反应液，2 μLTapDNA 聚合酶，2 μL 模板 DNA。PCR扩增程序为：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。反应结束后取5 μL PCR产物于1% 1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测(90 V，30 min)，凝胶成像系统拍照记录。结果显示，病料中检测出支原体特异性核酸阳性条带(图5)，测序结果与预期相符，说明黑叶猴为支原体感染。

3.5 结核分支杆菌的检测 将送检的2份发病黑叶猴血样于4 ℃过夜，8 000 r/min 离心 10 min，分别吸取上清于全新离心管中，标记后严格按照结核分枝杆菌抗体检测试剂盒(购自福建省明溪海天蓝波生物技术有限公司)操作说明，按照判断标准进行结核分枝杆菌抗体检测。结果显示结核分支杆菌检测呈阳性。

图5 黑叶猴支原体PCR检测

4 确诊

根据临床症状、病理剖检诊断及实验室检验，确诊该动物园黑叶猴为支原体、链球菌及结核分支杆菌混合感染。

5 防治

首先对有临床症状的黑叶猴立即进行隔离饲养，并进行针对性治疗。由于支原体无细胞壁，因此应选择作用于细菌蛋白质合成的相关药物治疗效果较好。所以本次对该动物园黑叶猴支原体及链球菌混合感染的具体治疗方法为：左氧氟沙星1片/次，2次/d；卡那霉素，3～5 mL/次，2次/d；连用5 d；并结合中药处方白矾散加减：白矾5 g、白芷5 g、浙贝母5 g、葶苈子5 g、黄连5 g、黄芩5 g、大黄4 g、郁金5 g、甘草5 g、桔梗5 g、紫苑5 g、冬花5 g、水煎后加蜂蜜25 g，每天3次灌服，连用3剂，用药时应使用足够剂量与疗程。而针对结核分支杆菌的感染主要是以预防为主，加强引进检疫制度，并用卡介苗进行预防接种后，隔离观察；由于结核病为人兽共患病，因此加强养殖人员的自身防护也应引起高度重视。此外，患病黑叶猴群除隔离治疗以外还需带猴消毒，并对被粪便、血液等的污染物及弃尸地、圈舍、用具等用10%漂白粉严格消毒，病死黑叶猴及污染物则彻底焚烧或深埋。粪便堆积后用5%氢氧化钠液表面消毒后生物热处理，并对水源、圈舍等黑叶猴活动过的地方用0.5%消特灵进行喷洒消毒，1次/d，连续消毒3 d。

其次对黑叶猴进行免疫接种，能有效的预防和控制支原体肺炎的发生；在幼猴1月龄时进行灭活苗的免疫，肌肉注射，每头接种0.5 mL，2周后加强免疫1 mL，能起到很好的防治效果。